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Preparato delle cellule per citometria a flusso

La citometria a flusso è una tecnica popolare usata per misurare l'espressione delle molecole, per identificare le celle e per analizzare la dimensione ed il volume delle cellule. Comprende il più comunemente contrassegnare le celle con gli anticorpi fluorescenti o i leganti, che legano gli obiettivi specifici nella cella da individuare.

Da HakatCredito di immagine: Hakat/Shutterstock

Tipi di campioni

I campioni più semplici da preparare per citometria a flusso sono cellule di cultura sospese, microrganismi portati dall'acqua, batteri e lievito. L'intero sangue è egualmente relativamente di facile impiego, perché i globuli rossi possono essere eliminati da lisi ed i tipi bianchi del globulo possono poi essere identificati.

Gli unicellulari devono essere prodotti dai tessuti solidi per citometria a flusso. Ciò è fatta disgregando il tessuto. La disgregazione meccanica funziona bene per i tessuti che sono limitati senza bloccare, quali le celle aderenti dalla cultura del tessuto, midollo osseo ed il tessuto linfoide.

Nella disgregazione meccanica, il tessuto tagliato in una sospensione è mosso ripetutamente attraverso un ago di stampa fine-misurato. Ciò può essere seguita dalla macinazione, se necessario.

Il tessuto può anche essere disgregato dagli enzimi. Nella disgregazione enzimatica, gli enzimi disturbano le interazioni fra le proteine e la matrice extracellulare che sta tenendo insieme le celle. Gli enzimi sono scelti hanno basato sui fattori quali pH, la temperatura ed altri cofattori, che tutti influenzano l'atto degli enzimi.

Macchiatura di immunofluorescenza diretta ed indiretta

Ci sono le tecniche della coloritura differenti per citometria a flusso. Fra questi è l'immunofluorescenza che macchia, che può essere diretta o indiretta. La macchiatura diretta dell'immunofluorescenza comprende curare le celle con un anticorpo fluorescente contrassegnato.

La macchiatura indiretta a volte è chiamata la tecnica del panino, in cui il reagente primario non è contrassegnato ma invece è individuato da un reagente secondario che fluorocromo-è contrassegnato. Questi possono sia essere anticorpi, in cui l'anticorpo secondario ha specificità per quella primaria.

In generale, la macchiatura dell'immunofluorescenza è facile, ma la specificità e l'intensità obbligatorie possono essere influenzate da parecchi fattori.

Macchiatura unicellulare

La macchiatura unicellulare è una tecnica usata per la rilevazione degli antigeni di superficie. Il tessuto linfoide o il sangue periferico è esempi di che sospensioni unicellulari può essere fatto.

In questo metodo, le celle sono incubate in tubi o lastre grosse di microtitolo (placche piane con molti pozzi che possono essere usati per alloggiare le soluzioni) con gli anticorpi. Gli anticorpi possono essere adenoidi o contrassegnati con la fluorescenza. Le celle poi sono lavate con una soluzione tampone per eliminare gli anticorpi che non hanno legato alle celle.

La sospensione unicellulare può anche essere usata per la rilevazione degli antigeni intracellulari. Ciò richiede la membrana di plasma di permettere le tinture o gli anticorpi da parte a parte, dalle sospensioni unicellulari fisse e permeabilized. Può misurare esattamente il contenuto cellulare del DNA. Più ulteriormente, la perdita delle cellule è bassa, che i mezzi possono essere eseguiti appena su alcune celle.

I protocolli per preparare le celle per citometria a flusso unicellulare della sospensione possono essere modificati per individuare gli antigeni, che differiscono leggermente nella loro sensibilità a denaturazione, o in come i soggiorni dell'anticorpo limitano all'antigene dopo il permeabilization della cella.

Gli antigeni interni e di superficie di una cella possono essere misurati simultaneamente dalla macchiatura delle entrambe la superficie delle cellule per l'espressione dell'antigene come pure dall'intracellulare per l'espressione dell'antigene. Tuttavia, il tipo di contrassegno dell'anticorpo è importante, come alcuno, quale la fluorescenza della proteina della clorofilla del peridinin (PerCP), è perso dopo il permeabilization.

Macchiatura non vitale delle cellule

Le celle non vitali sono celle morte e quindi hanno perso la loro integrità della membrana. Ciò significa che non possono essere utilizzate nei preparati fissi o permeabilized delle cellule. 7 il aminoactinomycin D, o 7-AAD, può essere usato qui. 7-AAD fluorescente può legare il DNA, ma questo può essere bloccato dall'inclusione dadell'actinomicina D, o dall'ANNUNCIO, che non è fluorescente.

Cellule di cultura del tessuto

La preparazione delle celle dalla cultura del tessuto è generalmente più facile delle sospensioni unicellulari. Le celle che si sviluppano in sospensione possono essere versate gradualmente in un tubo centrifugo, essere centrifugate ed essere risospese in citometria a flusso che macchia il buffer.

Le linee cellulari aderenti devono in primo luogo essere distaccate. Una volta che distaccati, i mucchi restanti devono essere dissociati. Poi possono essere centrifugati e risospesi in citometria a flusso che macchia il buffer ed essere usati per citometria a flusso.

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Last Updated: Oct 23, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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