Aviso: Esta página é uma tradução automática da página original em inglês. Por favor note uma vez que as traduções são geradas por máquinas, não tradução tudo será perfeita. Este site e suas páginas da Web destinam-se a ler em inglês. Qualquer tradução deste site e suas páginas da Web pode ser imprecisas e imprecisos no todo ou em parte. Esta tradução é fornecida como uma conveniência.

Preparação da pilha para o Cytometry de fluxo

O cytometry de fluxo é uma técnica popular usada para medir a expressão das moléculas, para identificar pilhas, e para analisar o tamanho e o volume de pilha. Envolve o mais geralmente etiquetar pilhas com os anticorpos fluorescentes ou as ligantes, que ligam alvos específicos na pilha a ser detectada.

Por HakatCrédito de imagem: Hakat/Shutterstock

Tipos de amostras

As amostras as mais simples a preparar-se para o cytometry de fluxo são pilhas de cultura suspendidas, micro-organismos aquáticas, bactérias e fermento. O sangue inteiro é igualmente relativamente fácil de usar, porque os glóbulos vermelhos podem ser removidos pelo lysis e os tipos brancos do glóbulo podem então ser identificados.

As únicas pilhas precisam de ser produzidas dos tecidos contínuos para o cytometry de fluxo. Isto é feito desagregando o tecido. A desagregação mecânica trabalha bem para os tecidos que são limitados frouxamente, como pilhas aderentes da cultura do tecido, medula, e o tecido lymphoid.

Na desagregação mecânica, o tecido desbastado em uma suspensão é movido através de uma agulha fino-calibrada repetidamente. Isto pode ser seguido mmoendo, caso necessário.

O tecido pode igualmente ser desagregado por enzimas. Na desagregação enzimático, as enzimas perturbam interacções entre proteínas e a matriz extracelular que está mantendo as pilhas unidas. As enzimas são escolhidas basearam em factores tais como o pH, a temperatura, e os outros cofactor, que todos influenciam a acção das enzimas.

Mancha da imunofluorescência directa e indirecta

Há umas técnicas de mancha diferentes para o cytometry de fluxo. Entre estes é a imunofluorescência que mancha, que pode ser directa ou indirecta. A mancha directa da imunofluorescência envolve tratar pilhas com um anticorpo fluorescente etiquetado.

A mancha indirecta é chamada às vezes a técnica do sanduíche, onde o reagente preliminar não é etiquetado mas é detectado pelo contrário por um reagente secundário que fluorochrome-seja etiquetado. Estes podem ser os anticorpos, onde o anticorpo secundário tem a especificidade para preliminar.

Total, a mancha da imunofluorescência é fácil, mas a especificidade e a intensidade obrigatórias podem ser influenciadas por diversos factores.

Única mancha da pilha

A única mancha da pilha é uma técnica usada para a detecção dos antígenos de superfície. O tecido Lymphoid ou o sangue periférico são exemplos de que únicas suspensões da pilha pode ser feito.

Neste método, as pilhas são incubadas nas câmaras de ar ou nas placas de microtiter (placas lisas com muitos poços que podem ser usados para abrigar soluções) com anticorpos. Os anticorpos podem ser sem etiqueta ou etiquetados com fluorescência. As pilhas são lavadas então com uma solução de amortecedor para remover os anticorpos que não ligaram às pilhas.

A única suspensão da pilha pode igualmente ser usada para a detecção de antígenos intracelulares. Isto exige a membrana de plasma permitir completamente tinturas ou anticorpos, únicas por suspensões fixas e permeabilized da pilha. Pode exactamente medir o índice celular do ADN. Mais, a perda da pilha é baixa, que os meios ele podem ser executados apenas em algumas pilhas.

Os protocolos para preparar pilhas para o cytometry de fluxo da suspensão da único-pilha podem ser alterados para detectar os antígenos, que diferem ligeira em sua sensibilidade à desnaturação, ou em como as estadas do anticorpo limitam ao antígeno após o permeabilization da pilha.

Os antígenos internos e de superfície de uma pilha podem ser medidos simultaneamente manchando ambos a superfície da pilha para a expressão do antígeno, assim como pelo intracelular para a expressão do antígeno. Contudo, o tipo de rotulagem do anticorpo é importante, como algum, tal como a fluorescência da proteína da clorofila do peridinin (PerCP), é perdido após o permeabilization.

mancha Não-viável da pilha

as pilhas Não-viáveis são pilhas inoperantes, e perderam conseqüentemente sua integridade da membrana. Isto significa que não podem ser usados em preparações fixas ou permeabilized da pilha. 7 o aminoactinomycin D, ou 7-AAD, podem ser usados aqui. 7-AAD fluorescente pode ligar o ADN, mas este pode ser obstruído incluir a actinomicina D, ou pelo ANÚNCIO, que não é fluorescente.

Pilhas de cultura do tecido

Preparar pilhas da cultura do tecido é geralmente mais fácil do que únicas suspensões da pilha. As pilhas que são crescidas em suspensão podem gradualmente ser derramadas em uma câmara de ar de centrifugador, ser centrifugadas, e resuspended em um cytometry de fluxo que mancha o amortecedor.

As linha celular aderentes precisam primeiramente de ser destacadas. Uma vez que destacados, os grupos restantes precisam de ser dissociados. Então podem ser centrifugados e resuspended em um cytometry de fluxo que mancha o amortecedor e ser usados para o cytometry de fluxo.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Oct 23, 2018

Sara Ryding

Written by

Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

Citations

Please use one of the following formats to cite this article in your essay, paper or report:

  • APA

    Ryding, Sara. (2018, October 23). Preparação da pilha para o Cytometry de fluxo. News-Medical. Retrieved on January 24, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/Cell-Preparation-for-Flow-Cytometry.aspx.

  • MLA

    Ryding, Sara. "Preparação da pilha para o Cytometry de fluxo". News-Medical. 24 January 2021. <https://www.news-medical.net/life-sciences/Cell-Preparation-for-Flow-Cytometry.aspx>.

  • Chicago

    Ryding, Sara. "Preparação da pilha para o Cytometry de fluxo". News-Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/Cell-Preparation-for-Flow-Cytometry.aspx. (accessed January 24, 2021).

  • Harvard

    Ryding, Sara. 2018. Preparação da pilha para o Cytometry de fluxo. News-Medical, viewed 24 January 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/Cell-Preparation-for-Flow-Cytometry.aspx.

Comments

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News Medical.