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Preparación de la célula para el Cytometry de flujo

El cytometry de flujo es una técnica popular usada para medir la expresión de moléculas, para determinar las células, y para analizar talla y el volumen de célula. Implica lo más común posible el etiqueta de las células con los anticuerpos fluorescentes o los ligands, que atan objetivos específicos en la célula que se descubrirá.

Por HakatHaber de imagen: Hakat/Shutterstock

Tipos de muestras

Las muestras más simples a prepararse para el cytometry de flujo son células de cultura suspendidas, microorganismos flotantes, bacterias y levadura. La sangre entera es también relativamente fácil de utilizar, porque los glóbulos rojos pueden ser quitados por la lisis y los tipos blancos del glóbulo pueden entonces ser determinados.

Las células necesitan ser producidas de los tejidos sólidos para el cytometry de flujo. Esto es hecha desagregando el tejido. La desagregación mecánica trabaja bien para los tejidos que están limitados flojo, por ejemplo las células adherentes de la cultura del tejido, médula, y el tejido linfoide.

En la desagregación mecánica, el tejido truncado en una suspensión se mueve a través de una aguja fino-calibrada en varias ocasiones. Esto puede ser seguida esmerilando, en caso de necesidad.

El tejido se puede también desagregar por las enzimas. En la desagregación enzimática, las enzimas perturban acciones recíprocas entre las proteínas y la matriz extracelular que está llevando a cabo las células juntas. Se eligen las enzimas basaron en factores tales como pH, temperatura, y otros cofactores, que todas influencian la acción de las enzimas.

Coloración de la inmunofluorescencia directa e indirecta

Hay diversas técnicas de coloración para el cytometry de flujo. Entre éstos es la inmunofluorescencia que mancha, que puede ser directa o indirecta. La coloración directa de la inmunofluorescencia implica el tratar de las células con un anticuerpo fluorescente etiqueta.

La coloración indirecta a veces se llama la técnica del bocadillo, en donde el reactivo primario no etiqueta sino en lugar de otro es descubierto por un reactivo secundario que fluorocromo-etiqueta. Éstos pueden ser los anticuerpos, donde el anticuerpo secundario tiene especificidad para la primaria.

Total, la coloración de la inmunofluorescencia es fácil, pero la especificidad y la intensidad obligatorias se pueden influenciar por varios factores.

Coloración unicelular

La coloración unicelular es una técnica usada para la detección de los antígenos superficiales. El tejido linfoide o la sangre periférica es ejemplos de qué suspensiones unicelulares puede ser hecho.

En este método, las células se incuban en los tubos o las placas de microtítulo (placas llanos con muchos pozos que se pueden utilizar para contener soluciones) con los anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser sin etiqueta o etiqueta con fluorescencia. Las células entonces se lavan con una solución tampón para quitar los anticuerpos que no ataron a las células.

La suspensión unicelular se puede también utilizar para la detección de antígenos intracelulares. Esto requiere la membrana de plasma permitir los tintes o los anticuerpos a través, por las suspensiones unicelulares fijas y permeabilized. Puede medir exacto el contenido celular de la DNA. Además, la baja de la célula es inferior, que los medios él se pueden realizar en apenas algunas células.

Los protocolos para preparar las células para el cytometry de flujo unicelular de la suspensión se pueden modificar para descubrir los antígenos, que difieren ligeramente en su sensibilidad a la desnaturalización, o en cómo los retenes del anticuerpo limitan al antígeno después del permeabilization de la célula.

Los antígenos internos y superficiales de una célula se pueden medir simultáneamente manchando ambas la superficie de la célula para la expresión del antígeno, así como el intracelular para la expresión del antígeno. Sin embargo, el tipo de etiqueta del anticuerpo es importante, como algo, tal como fluorescencia de la proteína de la clorofila del peridinin (PerCP), se pierde después del permeabilization.

Coloración no viable de la célula

Las células no viables son células muertas, y por lo tanto han perdido su integridad de la membrana. Esto significa que no pueden ser utilizadas en preparaciones fijas o permeabilized de la célula. 7 el aminoactinomycin D, o 7-AAD, se puede utilizar aquí. 7-AAD fluorescente puede atar la DNA, pero esto se puede cegar incluyendo la actinomicina D, o el ANUNCIO, que no es fluorescente.

Células de cultura del tejido

La preparación de las células de la cultura del tejido es generalmente más fácil que las suspensiones unicelulares. Las células que se crecen en suspensión se pueden verter gradualmente en un tubo de centrífuga, centrifugar, y suspender de nuevo en un cytometry de flujo que mancha el almacenador intermedio.

Las variedades de células adherentes necesitan primero ser separadas. Una vez que están destacados, los grupos restantes necesitan ser desasociados. Después pueden ser centrifugados y ser suspendidos de nuevo en un cytometry de flujo que mancha el almacenador intermedio y ser utilizados para el cytometry de flujo.

Fuentes

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Last Updated: Oct 23, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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