avantages et limitations Frite-seq

l'immunoprécipitation Frite-seq, ou de chromatine et l'ordonnancement, est une technique qui permet à des chercheurs de comprendre le règlement transcriptionnel par l'intermédiaire du mappage des interactions ADN-protéines et des bornes épigénétiques sur une échelle de la taille du génome. Frite-seq a plusieurs avantages par rapport aux méthodes précédentes, telles que la Frite-frite, mais comme toutes les techniques, Frite-seq a ses limitations.

Cellule montrant la chromatine au noyauurfin | Shutterstock

Frite-seq

Frite-seq était une des premières applications du prochain rétablissement ordonnançant, qui était en mi-2000 S. développé. Son précurseur, la Frite-frite, analyse impliquée des éclats par l'intermédiaire de l'hybridation à une puce ADN, qui a montré les interactions d'ADN-protéine. Frite-seq, utilisant le prochain rétablissement ordonnançant, peut directement ordonnancer les éclats d'objectif plutôt que les hybridant sur des choix.

En bref, Frite-seq fait participer les cellules de traitement du formaldéhyde pour réticuler les protéines obligatoires à l'ADN in vivo. La chromatine est alors tondue utilisant la sonication dans de plus petits éclats de l'ordre du point d'ébullition 200-600.

Des anticorps spécifiques à la protéine cible sont employés à l'immunoprecipitate le composé d'ADN-protéine. La dernière opération concerne l'inversion des réticulations et du desserrage de l'ADN, qui est séquencé sur n'importe quelle plate-forme de la deuxième génération pour recenser les séquences liées par la protéine.

Avantages de Frite-seq

Comparé à la Frite-frite, la technologie Frite-seq active la définition au niveau unique de paire de bases, à moins corps étrangers, à couverture améliorée, et à dynamique plus étendue. L'excellente définition de paire de bases est l'un des la plupart des avantages importants, parce que les choix ont une incertitude principale dans le procédé d'hybridation qui limite la définition. Tandis que la définition pour la Frite-frite variée par des choix mais était généralement de l'ordre du point d'ébullition 30-100, Frite-seq a la définition unique de nucléotide.

La dérivation du procédé d'hybridation a des allocations complémentaires pour Frite-seq. Pendant le procédé de l'hybridation des Frite-frites il peut y avoir la croix-hybridation entre les séquences imparfaitement appariées, qui ajoute au bruit de signe. Frite-seq est intrinsèquement immunisé contre de telles sources de bruit dues à la méthode l'ordonnancement directe. Cependant, il est possible de recevoir de la Chromatographie-polarisation utilisant Frite-seq.

Frite-seq a amélioré la définition comparée à d'autres méthodes. Le signe de l'intensité du choix peut ne pas être entièrement linéaire, et la dynamique du choix est limitée au delà des points de saturation. Ceci mène à eux étant gênés dans la Frite-frite, mais Frite-non seq, expériences. Frite-seq n'a pas une dynamique limitée, par opposition à la limite de la détection des Frite-frites plus bas.

Le prochain rétablissement ordonnançant la technique signifie que la couverture de génome n'est pas limitée aux séquences de sonde fixes sur le choix. Des régions répétitives de génome, telles que l'hétérochromatine ou les microsatellites, sont habituellement masquées à l'extérieur sur des choix, mais peuvent s'analyser effectivement utilisant Frite-seq.

Frite-seq a davantage d'avantage au-dessus de Frite-frite en ce qui concerne la quantité d'échantillon, car un peu sont nécessaires pour Frite-seq. Frite-seq produit d'une liste plus précise d'accepteurs de protéine et d'objectifs des facteurs de transcription, des amplificateurs, et d'identification des motifs de séquence. Positionner de Nucleosome et modifications goujon-de translation des variantes de chromatine et d'histone peuvent s'analyser utilisant Frite-seq. De tels avantages d'analyse particulièrement de résolution spatiale améliorée.

Limitations de Frite-seq

Les limitations primaires de Frite-seq est accès et coût. Des coûts peuvent être atténués par des chercheurs développant leurs propres protocoles pour construire des bibliothèques, mais le prix général doit encore être encore réduit à un minimum pour être comparable à d'autres méthodes. les techniques de Frite-frite ont coûté environ 400-800 USD selon le choix, par rapport à Frite-seq coûte 1,000-2,000 USD selon la voie (pour une telle plate-forme de prochain rétablissement).

Puisque Frite-seq se sert des anticorps dans l'immunoprécipitation, la qualité des caractéristiques se fonde sur la qualité de l'anticorps. Plusieurs anticorps disponibles dans le commerce varient considérablement de la qualité, pas simplement entre les fournisseurs mais également entre les lots. La qualité d'anticorps peut être validée, mais de tels procédés sont laborieux et longs.

Les crêtes dans les profils produits par le besoin Frite-seq d'être comparé aux mêmes lieux dans un échantillon témoin pour s'assurer la signification de la crête. Ceci est habituellement fait avec l'ADN avant l'immunoprécipitation, l'ADN traité mais manquer de l'anticorps, et employer un anticorps qui n'a aucune participation de grippement d'ADN ou de modification de chromatine (telle que l'IgG). Ceci permet à des scientifiques de surmonter un grand choix de corps étrangers qui pourraient avoir été introduits, mais il n'y a actuel aucun accord sur lequel le contrôle est les la plupart appropriées, et les trois méthodes peuvent différer dans la régularité.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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