vantaggi e limitazioni Chip-seguenti

l'immunoprecipitazione della cromatina o e Chip-seguente ed ordinare, è una tecnica che permette che i ricercatori capiscano il regolamento trascrizionale via la mappatura delle interazioni proteina-DNA e degli indicatori epigenetici su un disgaggio genoma di ampiezza. Chip-seguente presenta parecchi vantaggi sopra i metodi precedenti, quale il Chip-chip, ma come tutte le tecniche, Chip-seguenti presenta le sue limitazioni.

Cella che mostra cromatina nel nucleourfin | Shutterstock

Chip-seguente

Chip-seguente era una delle prime applicazioni della generazione seguente che ordinano, che era nel della metà del 2000 S. sviluppato. Il suo precursore, il Chip-chip, analisi implicata dei frammenti via l'ibridazione ad un microarray, che ha mostrato le interazioni della DNA-proteina. Chip-seguente, facendo uso della generazione seguente che ordina, può direttamente ordinare i frammenti dell'obiettivo piuttosto che ibridandole sulle schiere.

In breve, Chip-seguente fa partecipare le celle di trattamento con formaldeide per unire con legami atomici incrociati le proteine obbligatorie a DNA in vivo. La cromatina poi scorrimento facendo uso di sonicazione nei più piccoli frammenti nell'ordine di 200-600 B.P.

Gli anticorpi specifici alla proteina bersaglio sono usati a immunoprecipitate il complesso della DNA-proteina. L'ultimo punto comprende l'inversione dei legami incrociati e della versione di DNA, che è ordinato su tutta la piattaforma di prossima generazione per identificare le sequenze limitate dalla proteina.

Vantaggi di Chip-seguente

Confrontato al Chip-chip, la tecnologia Chip-seguente permette alla risoluzione al singolo livello della coppia di basi, a meno artefatti, a copertura migliore ed a più vasta gamma dinamica. La risoluzione eccellente della coppia di basi è uno dei vantaggi più significativi, perché le schiere hanno incertezza fondamentale nel trattamento di ibridazione che limita la risoluzione. Mentre la risoluzione per il Chip-chip diverso tramite le schiere ma era generalmente nell'ordine di 30-100 B.P., Chip-seguente ha singola risoluzione del nucleotide.

Oltrepassare il trattamento di ibridazione ha assegni complementari per Chip-seguente. Durante il trattamento dell'ibridazione dei Chip-chip ci può essere inter-ibridazione fra le sequenze imperfettamente abbinate, che aggiunge a disturbo del segnale. Chip-seguente è intrinsecamente immune a tali sorgenti di disturbo dovuto il metodo ordinare diretto. Tuttavia, è possibile ricevere una certa Gascromatografia-tendenziosità facendo uso di Chip-seguente.

Chip-seguente ha migliorato la risoluzione confrontata ad altri metodi. Il segnale dell'intensità della schiera non può essere interamente lineare e la gamma dinamica della schiera è limitata oltre i punti di saturazione. Ciò piombo a loro che sono oscurati nel Chip-chip, ma Chip-non seguenti, esperimenti. Chip-seguente non ha una gamma dinamica limitata, rispetto al limite di segnalazione dei Chip-chip più in basso.

La generazione seguente che ordina la tecnica significa che la copertura del genoma non si limita alle sequenze della sonda fissate sulla schiera. Le regioni ripetitive del genoma, quali eterocromatina o microsatellites, sono mascherate solitamente fuori sulle schiere, ma possono essere analizzate efficacemente facendo uso di Chip-seguente.

Chip-seguente ha ulteriore vantaggio sopra il Chip-chip riguardo alla quantità del campione, poichè i più piccoli importi sono necessari per Chip-seguente. Chip-seguente compilare una lista più precisa delle sedi del legame della proteina e degli obiettivi dei fattori di trascrizione, dei rinforzatori e dell'identificazione dei motivi di sequenza. Il posizionamento di Nucleosome e le modifiche post-di traduzione delle varianti dell'istone e della cromatina possono essere analizzati facendo uso di Chip-seguente. Tale analisi trae giovamento particolarmente da risoluzione spaziale migliorata.

Limitazioni di Chip-seguente

Le limitazioni primarie di Chip-seguente è accesso e costo. I costi possono attenuarsi dai ricercatori che sviluppano i loro propri protocolli per la costruzione delle librerie, ma il prezzo globale deve ancora più ulteriormente essere minimizzato per essere comparabile ad altri metodi. il costo di tecniche del Chip-chip intorno a 400-800 USD per schiera, rispetto aChip-seguente costa 1,000-2,000 USD per corsia (per una tale piattaforma della generazione seguente).

Poiché Chip-seguente usa gli anticorpi nell'immunoprecipitazione, la qualità dei dati conta sulla qualità dell'anticorpo. Parecchi anticorpi disponibili nel commercio variano ampiamente nella qualità, non appena fra i fornitori ma anche fra i batch. La qualità dell'anticorpo può essere convalidata, ma tali trattamenti sono laboriosi e che richiede tempo.

I picchi nei profili generati da necessità Chip-seguente di essere confrontato agli stessi luoghi in un campione di controllo per accertare del significato del picco. Ciò è fatta solitamente con DNA prima di immunoprecipitazione, DNA trattato ma la mancanza dell'anticorpo ed usando un anticorpo che non ha partecipazione dell'associazione del DNA o di modifica della cromatina (quale IgG). Ciò permette che gli scienziati sormontino vari artefatti che potrebbero essere introdotti, ma non c'è corrente consenso su cui il controllo è la maggior parte appropriato ed i tre metodi possono differire nella consistenza.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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