vantagens e limitações Microplaqueta-segs.s

a imunoprecipitação Microplaqueta-segs., ou da cromatina e arranjar em seqüência, são uma técnica que permita que os pesquisadores compreendam o regulamento transcricional através do traço das interacções proteína-ADN e de marcadores epigenéticos em uma escala genoma-larga. Microplaqueta-segs. tem diversas vantagens sobre métodos precedentes, tais como a Microplaqueta-microplaqueta, mas como todas as técnicas, Microplaqueta-segs.s tem suas limitações.

Pilha que mostra a cromatina no núcleourfin | Shutterstock

Microplaqueta-segs.

Microplaqueta-segs. era uma das primeiras aplicações da próxima geração que arranjam em seqüência, que era em meados de 2000 S. desenvolvido. Seu precursor, a Microplaqueta-microplaqueta, análise involvida dos fragmentos através da hibridação a um microarray, que mostrasse as interacções da ADN-proteína. Microplaqueta-segs., usando a próxima geração que arranja em seqüência, pode directamente arranjar em seqüência os fragmentos do alvo um pouco do que cruzando os em disposições.

Em curto, Microplaqueta-segs. envolve pilhas de tratamento com o formaldeído para ligar in vivo proteínas obrigatórias ao ADN. A cromatina é cortada então usando o sonication em fragmentos menores na escala de 200-600 bp.

Os anticorpos específicos à proteína do alvo são usados ao immunoprecipitate o complexo da ADN-proteína. A última etapa envolve a reversão das ligações transversais e da liberação do ADN, que é arranjado em seqüência em toda a plataforma da próxima geração para identificar as seqüências limitadas pela proteína.

Vantagens de Microplaqueta-segs.

Comparado à Microplaqueta-microplaqueta, a tecnologia Microplaqueta-segs. permite a definição nos únicos pares baixos em nível, menos produtos manufacturados, cobertura melhorada, e alcance dinâmico maior. O base-par excelente da definição é uma das vantagens as mais significativas, porque as disposições têm a incerteza fundamental no processo da hibridação que limita a definição. Quando a definição para a Microplaqueta-microplaqueta variada por disposições mas estava geralmente na escala de 30-100 bp, Microplaqueta-segs. tem a única definição do nucleotide.

Contornear o processo da hibridação tem benefícios adicionais para Microplaqueta-segs. Durante o processo da hibridação das Microplaqueta-microplaquetas pode haver a cruz-hibridação entre seqüências imperfeita combinadas, que adiciona ao ruído do sinal. Microplaqueta-segs. é intrìnseca imune a tais fontes de ruído devido ao método arranjar em seqüência directo. Contudo, é possível receber alguma utilização da GC-polarização Microplaqueta-segs.

Microplaqueta-segs. melhorou a definição comparada a outros métodos. O sinal da intensidade da disposição não pode ser inteiramente linear, e o alcance dinâmico da disposição é limitado além dos pontos de saturação. Isto conduz-lhes que estão sendo obscurecidos na Microplaqueta-microplaqueta, mas Microplaqueta-nao segs.s, experiências. Microplaqueta-segs. não tem um alcance dinâmico limitado, ao contrário do limite de detecção das Microplaqueta-microplaquetas mais baixo.

A próxima geração que arranja em seqüência a técnica significa que a cobertura do genoma não está restringida às seqüências da ponta de prova fixadas na disposição. As regiões repetitivas do genoma, tais como o heterochromatin ou os microsatellites, são mascaradas geralmente para fora em disposições, mas podem ser eficazmente utilização analisada Microplaqueta-segs.

Microplaqueta-segs. tem um benefício mais adicional sobre a Microplaqueta-microplaqueta no que diz respeito à quantidade da amostra, porque as quantidades menores são necessários para Microplaqueta-segs. Microplaqueta-segs. gera uma lista mais precisa de locais obrigatórios da proteína e de alvos de factores da transcrição, de realçadores, e de identificação de motivos da seqüência. O posicionamento de Nucleosome e as alterações cargo-translational de variações da cromatina e do histone podem ser utilização analisada Microplaqueta-segs. Tal análise tira proveito especialmente da definição espacial aumentada.

Limitações de Microplaqueta-segs.

As limitações preliminares de Microplaqueta-segs. são acesso e custo. Os custos podem ser abrandados pelos pesquisadores que desenvolvem seus próprios protocolos para construir bibliotecas, mas o preço total deve ainda mais ser minimizado para ser comparável a outros métodos. o custo das técnicas da Microplaqueta-microplaqueta em torno de 400-800 USD pela disposição, em comparação com Microplaqueta-segs. custa 1,000-2,000 USD pela pista (para uma tal plataforma da próxima geração).

Porque Microplaqueta-segs. utiliza anticorpos na imunoprecipitação, a qualidade dos dados confia na qualidade do anticorpo. Diversos anticorpos disponíveis no comércio variam extensamente na qualidade, não apenas entre fornecedores mas igualmente entre grupos. A qualidade do anticorpo pode ser validada, mas tais processos são laboriosos e demorados.

Os picos nos perfis gerados pela necessidade Microplaqueta-segs. de ser comparado aos mesmos locus em uma amostra de controle para verificar o significado do pico. Isto é feito geralmente com ADN antes da imunoprecipitação, ADN tratado mas falta do anticorpo, e utilização de um anticorpo que não tenha nenhuma participação do emperramento do ADN ou da alteração da cromatina (tal como IgG). Isto permite que os cientistas superem uma variedade de produtos manufacturados que poderiam ter sido introduzidos, mas não há actualmente nenhum consenso em que o controle é o mais apropriado, e os três métodos podem diferir na consistência.

Fontes

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Last Updated: Feb 26, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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