ventajas y limitaciones Viruta-seq

la inmunoprecipitación Viruta-seq, o de la cromatina y la secuencia, es una técnica que permite que los investigadores entiendan la regla transcriptiva vía la correspondencia de las acciones recíprocas proteína-DNA y de los marcadores epigenéticos en una escala genoma-ancha. Viruta-seq tiene varias ventajas sobre métodos anteriores, tales como Viruta-viruta, pero como todas las técnicas, Viruta-seq tiene sus limitaciones.

Célula que muestra cromatina en núcleourfin | Shutterstock

Viruta-seq

Viruta-seq era uno de los primeros usos de la generación siguiente que ordenaban, que era en mediados de 2000 S. desarrollado. Su precursor, la Viruta-viruta, análisis implicado de fragmentos vía el hibridación a un microarray, que mostró las acciones recíprocas de la DNA-proteína. Viruta-seq, usando la generación siguiente que ordena, puede ordenar directamente los fragmentos del objetivo bastante que cruzándolas por hibridación en matrices.

En fin, Viruta-seq implica las células que tratan con formaldehido para reticular las proteínas obligatorias a la DNA in vivo. La cromatina entonces se corta con tijeras usando la sonicación en fragmentos más pequeños en el rango del punto de ebullición 200-600.

Los anticuerpos específicos a la proteína del objetivo se utilizan al immunoprecipitate el complejo de la DNA-proteína. El paso pasado implica la revocación de las reticulaciones y de la baja de la DNA, que se ordena en cualquier plataforma de la siguiente-generación para determinar las series limitadas por la proteína.

Ventajas de Viruta-seq

Comparado a la Viruta-viruta, la tecnología Viruta-seq habilita la resolución en los únicos pares bajos nivelados, menos artefactos, abrigo perfeccionado, y rango dinámico más grande. El base-par excelente de la resolución es una de las ventajas más importantes, porque las matrices tienen incertidumbre fundamental en el proceso del hibridación que limita la resolución. Mientras que la resolución para la Viruta-viruta variada por matrices pero estaba generalmente en el rango del punto de ebullición 30-100, Viruta-seq tiene única resolución del nucleótido.

Sobrepasar el proceso del hibridación tiene ventajas adicionales para Viruta-seq. Durante el proceso del hibridación de las Viruta-virutas puede haber el cruz-hibridación entre las series imperfecto igualadas, que agrega al ruido de la señal. Viruta-seq es intrínseco inmune a tales fuentes del ruido debido al método la secuencia directo. Sin embargo, es posible recibir una cierta Cromatografía-polarización negativa usando Viruta-seq.

Viruta-seq ha perfeccionado la resolución comparada a otros métodos. La señal de la intensidad del arsenal puede no ser totalmente lineal, y el rango dinámico del arsenal es limitado más allá de los puntos de saturación. Esto lleva a ellos que son obscurecidos en Viruta-viruta, pero Viruta-no seq, experimentos. Viruta-seq no tiene un rango dinámico limitado, en comparación con el límite de la detección de las Viruta-virutas más bajo.

La generación siguiente que ordena técnica significa que el abrigo del genoma no está restringido a las series de la antena reparadas en el arsenal. Las regiones repetidores del genoma, tales como heterocromatina o microsatellites, se encubren generalmente fuera en matrices, pero se pueden analizar efectivo usando Viruta-seq.

Viruta-seq tiene ventaja adicional sobre Viruta-viruta en cuanto a cantidad de la muestra, pues cantidades más pequeñas son necesarias para Viruta-seq. Viruta-seq genera un filete más exacto de los puntos de enlace de la proteína y de los objetivos de los factores de la transcripción, de los reforzadores, y de la identificación de los adornos de la serie. La colocación de Nucleosome y las modificaciones poste-de translación de las variantes de la cromatina y de la histona se pueden analizar usando Viruta-seq. Tal análisis se beneficia especialmente de la resolución espacial aumentada.

Limitaciones de Viruta-seq

Las limitaciones primarias de Viruta-seq son acceso y costo. Los costos se pueden atenuar por los investigadores que desarrollan sus propios protocolos para construir bibliotecas, pero el precio total se debe todavía disminuir más a fondo para ser comparable a otros métodos. el costo de las técnicas de la Viruta-viruta alrededor de 400-800 USD por arsenal, con respecto a Viruta-seq cuesta 1,000-2,000 USD por senda (para una tal plataforma de la generación siguiente).

Porque es Viruta-seq hace uso de los anticuerpos en la inmunoprecipitación, la calidad de los datos confía en la calidad del anticuerpo. Varios anticuerpos disponibles en el comercio varían extensamente en calidad, no apenas entre los surtidores pero también entre las mezclas. La calidad del anticuerpo puede ser validada, pero tales procesos son laboriosos y que toma tiempo.

Los picos en los perfiles generados por necesidad Viruta-seq de ser comparado a los mismos lugares geométricos en una muestra de mando para comprobar la significación del pico. Esto se hace generalmente con la DNA antes de la inmunoprecipitación, la DNA tratada pero faltar el anticuerpo, y usar un anticuerpo que no tenga ninguna implicación del atascamiento de la DNA o de la modificación de la cromatina (tal como IgG). Esto permite que los científicos venzan una variedad de artefactos que habrían podido ser introducidos, pero no hay actualmente consenso en el cual el mando es el más apropiado, y los tres métodos pueden diferir en estado coherente.

Fuentes

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Last Updated: Feb 26, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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