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préparation Frite-seq de bibliothèque

Il est possible de profiler les protéines, les modifications d'histone, et les nucleosomes ADN-grippants d'un génome entier utilisant l'immunoprécipitation de chromatine suivie de l'ordonnancement, ou Frite-seq. La préparation d'une bibliothèque Frite-seq tient compte de l'étude du règlement de gène et des mécanismes épigénétiques.

Illustration des cellulesAlexandre Mozymov | Shutterstock

Préparation couronnée de succès de bibliothèque

La préparation normale de bibliothèque d'ADN n'est pas différente à la préparation Frite-seq de bibliothèque. Plusieurs méthodes commerciales existent, souvent adapté au prochain rétablissement ordonnançant la plate-forme Illumina appelé ordonnançant, qui peut également être utilisée dans la préparation normale de bibliothèque d'ADN. L'autre prochain rétablissement ordonnançant des plates-formes comprennent Helicos, Roche, et ABI. Une différence entre la préparation normale et Frite-seq de bibliothèque est la quantité d'entrée ADN, qui est couramment inférieure pour les bibliothèques Frite-seq.

Toute la frite expérimente orientation sur les protéines qui grippent l'ADN, ainsi commencent en réticulant les protéines ADN-grippantes à l'ADN. Ceci est type fait utilisant le formaldéhyde, suivi de la tonte sonication-induite. Ceci fournit de petits éclats de l'ordre du point d'ébullition 200 à 600. Un anticorps augmenté contre la protéine visée est employé à l'immunoprecipitate le composé de l'ADN et de la protéine. Les réticulations sont alors renversées, et l'ADN libre réduit en fragments est employé dans la préparation de bibliothèque.   

La préparation de bibliothèque pour Illumina suivent souvent le même contour général. L'entrée, comprenant l'ADN réduit en fragments, suit la demande de règlement pour réparer les extrémités et le phosphorylate l'extrémité 5 principale. Après ceci, l'adaptateur choisi est ligaturé et la pièce d'uracile de cet adaptateur est excisée. L'ACP est employé pour l'enrichissement et la duplication de boucle, les produits sont nettoyés et la bibliothèque est construite.

Recommandations pour la préparation de bibliothèque

Afin de construire les bibliothèques qui ont la bonne couverture et la polarisation inférieure, l'ADN de haute qualité et la préparation correcte de bibliothèque soyez nécessaire. Pendant la préparation, la guérison d'échantillon peut être maximisée à l'aide des tubes inférieurs d'assemblage qui réduisent à un minimum le grippement de l'ADN aux articles de plastique de laboratoire.

Tous les réactifs devraient être nouvellement préparés le jour où la bibliothèque est préparée. De même, les enzymes utilisées dans la préparation de bibliothèque tendent à avoir des régimes élevés de dégradation à la température ambiante, que des moyens ils doivent être chronique enregistré aux températures adaptées pour assurer le rendement de réaction.

La préparation de bibliothèque doit être précédée par quantification d'ADN. On lui recommande que cette quantification soit faite utilisant un fluoromètre parce que les techniques qui emploient les teintures de intercalation pour la quantification de l'ADN ont la sensibilité de grande précision et améliorée comparée aux spectromètres. La préparation de bibliothèque devrait être précédée et suivie de la vérification de la distribution de taille de l'échantillon, utilisant des machines de bioanalyzer.

Il est important d'employer un nécessaire d'ADN de sensibilité élevée pour garantir que la quantification et la qualification d'ADN est précise. Les adaptateurs utilisés dans la préparation de bibliothèque ajouteront le grammage à l'échantillon et devraient être tenus compte pendant la sélection de format.

Avant d'ordonnancer, les bibliothèques en préparation devraient être nettoyées et taille être sélectées pour retirer les fragments d'ADN non désirés, par exemple les amorces qui n'ont pas ligaturé ou les dimères d'amorce. L'ADN nettoient devrait également éliminer tous les fragments d'ADN qui sont en-dessous du point d'ébullition 200 de longueur.

Avant la synthèse de la bibliothèque, on lui informe que l'ADN immunoprecipitated s'analyse. Ceci est fait utilisant le qPCR avec un minimum d'un objectif positif et négatif de contrôle pour un gène spécifique choisi selon la condition.

Frite-seq exige d'un contrôle de comparer des crêtes d'analyse de séquences, et pour cette raison des contrôles doivent être préparés à côté de la bibliothèque. Tandis qu'aucun contrôle n'est universellement convenu en tant que l'optimal, le plus courant en service un de ce qui suit :

  • Entrez l'ADN, ou l'ADN qui pas immunoprecipitated
  • Raillez l'ADN, ou l'ADN qui n'est pas traité avec de l'anticorps pendant l'immunoprécipitation
  • Non spécifique, ou un anticorps qui est connu pour ne pas agir l'un sur l'autre avec l'ADN

En tant qu'anticorps Frite-seq d'utilisations, des expériences peuvent être limitées par utilisation d'anticorps. La meilleure bibliothèque sera construite utilisant un anticorps validé, car quelques anticorps ne sont pas compatibles avec le prochain rétablissement ordonnançant des plates-formes.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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