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preparato Chip-seguente delle biblioteche

È possibile profilare le proteine dell'DNA-associazione, le modifiche dell'istone e i nucleosomes di intero genoma facendo uso di immunoprecipitazione della cromatina seguita dall'ordinamento, o Chip-seguente. Il preparato di una libreria Chip-seguente tiene conto lo studio sul regolamento del gene e sui meccanismi epigenetici.

Illustrazione delle celleAlexander Mozymov | Shutterstock

Riuscito preparato delle biblioteche

Il preparato standard della libreria del DNA non è dissimile al preparato Chip-seguente delle biblioteche. Parecchi metodi commerciali esistono, adatto a spesso per la generazione seguente che ordina Illumina chiamato piattaforma che ordina, che può anche essere utilizzato nel preparato standard della libreria del DNA. L'altra generazione seguente che ordina le piattaforme include Helicos, Roche e ABI. Una differenza fra il preparato standard e Chip-seguente delle biblioteche è la quantità di DNA dell'input, che è comunemente più basso per le librerie Chip-seguenti.

Tutto il chip sperimenta fuoco sulle proteine che legano il DNA, in modo da comincia unendo con legami atomici incrociati le proteine dell'DNA-associazione a DNA. Ciò è fatta tipicamente facendo uso di formaldeide, seguita dal dallo scorrimento indotto da sonicazione. Ciò rende i piccoli frammenti nell'ordine di 200 a 600 B.P. Un anticorpo sollevato contro la proteina mirata a è usato a immunoprecipitate il complesso di DNA e di proteina. I legami incrociati poi sono invertiti ed il DNA libero spezzettato è utilizzato nel preparato delle biblioteche.   

Il preparato delle biblioteche per Illumina segue spesso lo stesso profilo generale. L'input, consistente del DNA spezzettato, subisce il trattamento per riparare le estremità ed il phosphorylate l'estremità principale 5. A seguito di questo, il convertitore scelto è legato e la parte dell'uracile di questo convertitore è asportata. La PCR è usata per arricchimento e la duplicazione del filo, i prodotti sono puliti e la libreria è costruita.

Raccomandazioni per il preparato delle biblioteche

Per costruire le librerie che hanno la buona copertura e tendenziosità bassa, sia DNA di alta qualità che preparato adeguato delle biblioteche sia necessario. Durante il preparato, il ripristino del campione può essere massimizzato usando i tubi bassi della conservazione che minimizzano il legame del DNA agli articoli della plastica del laboratorio.

Tutti i reagenti dovrebbero essere appeni preparato il giorno che la libreria è preparata. Similmente, gli enzimi utilizzati nel preparato delle biblioteche tendono ad avere alte tariffe di degradazione alla temperatura ambiente, che i mezzi essi devono essere memorizzati coerente alle temperature adatte per assicurare il risparmio di temi della reazione.

Il preparato delle biblioteche deve essere preceduto da quantificazione del DNA. È raccomandato che questa quantificazione sia fatta facendo uso di un fluorometro perché le tecniche che usano le tinture intercalanti per la quantificazione di DNA hanno il più alta accuratezza e sensibilità migliore confrontate agli spettrometri. Il preparato delle biblioteche dovrebbe sia essere preceduto che seguito dalla verifica della distribuzione di dimensione del campione, facendo uso dei commputer del bioanalyzer.

È importante usare un kit del DNA di alta sensibilità per garantire che la quantificazione e la qualificazione del DNA è accurate. I convertitori utilizzati nel preparato delle biblioteche aggiungeranno il peso al campione e dovrebbero essere considerati durante la selezione di dimensione.

Prima dell'ordinamento, le librerie in preparazione dovrebbero essere pulite e dimensione essere selezionate per eliminare le sequenze di DNA indesiderate, per esempio mani di fondo che non hanno legato o i dimeri della mano di fondo. Il DNA pulisce dovrebbe anche eliminare tutti i frammenti di DNA che sono inferiore a 200 B.P. di lunghezza.

Prima della sintesi della libreria, si consiglia che il DNA immunoprecipitated è analizzato. Ciò è fatta facendo uso di qPCR con un minimo di un obiettivo positivo e negativo di controllo per un gene specifico scelto secondo il requisito.

Chip-seguente richiede un controllo di confrontare i picchi dall'analisi di sequenza e quindi i comandi devono essere preparati accanto alla libreria. Mentre nessun controllo è accordato su universalmente come quello ottimale, più comuni quei in uso uno di quanto segue:

  • Introduca il DNA, o il DNA che non non immunoprecipitated
  • Derida il DNA, o il DNA che non è trattato con un anticorpo durante l'immunoprecipitazione
  • Non specifico, o un anticorpo che è conosciuto per non interagire con DNA

Come anticorpi Chip-seguenti di usi, gli esperimenti possono essere limitati tramite uso dell'anticorpo. La migliore libreria sarà costruita facendo uso di un anticorpo convalidato, poichè alcuni anticorpi non sono compatibili con la generazione seguente che ordina le piattaforme.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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