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preparação Microplaqueta-segs. da biblioteca

É possível perfilar as proteínas, as alterações do histone, e os nucleosomes ADN-obrigatórios de um genoma inteiro usando a imunoprecipitação da cromatina seguida arranjando em seqüência, ou Microplaqueta-segs. A preparação de uma biblioteca Microplaqueta-segs. permite o estudo do regulamento do gene e de mecanismos epigenéticos.

Ilustração das pilhasAlexander Mozymov | Shutterstock

Preparação bem sucedida da biblioteca

A preparação padrão da biblioteca do ADN não é dissimilar à preparação Microplaqueta-segs. da biblioteca. Diversos métodos comerciais existem, serido frequentemente para a próxima geração que arranja em seqüência Illumina chamado plataforma que arranja em seqüência, que pode igualmente ser usado na preparação padrão da biblioteca do ADN. A outra próxima geração que arranja em seqüência plataformas inclui Helicos, Roche, e ABI. Uma diferença entre a preparação padrão e Microplaqueta-segs. da biblioteca é a quantidade de ADN da entrada, que é geralmente mais baixo para bibliotecas Microplaqueta-segs.s.

Toda a microplaqueta experimenta foco nas proteínas que ligam o ADN, assim que começa ligando as proteínas ADN-obrigatórias ao ADN. Isto é feito tipicamente usando o formaldeído, seguido pelo corte sonication-induzido. Isto rende fragmentos pequenos na escala de 200 a 600 bp. Um anticorpo aumentado contra a proteína visada é usado ao immunoprecipitate o complexo do ADN e da proteína. As ligações transversais são invertidas então, e o ADN livre fragmentado é usado na preparação da biblioteca.   

A preparação da biblioteca para Illumina segue frequentemente o mesmo esboço geral. A entrada, consistindo no ADN fragmentado, submete-se ao tratamento para reparar as extremidades e o phosphorylate a extremidade 5 principal. Depois disto, o adaptador escolhido é ligado e a peça do uracil deste adaptador é extirpada. O PCR é usado para o enriquecimento e a duplicação da costa, os produtos são limpados e a biblioteca é construída.

Recomendações para a preparação da biblioteca

A fim construir as bibliotecas que têm a boa cobertura e a baixa polarização, o ADN de alta qualidade e preparação apropriada da biblioteca seja necessário. Durante a preparação, a recuperação da amostra pode ser maximizada usando as baixas câmaras de ar da retenção que minimizam o emperramento do ADN aos mercadorias do plástico do laboratório.

Todos os reagentes devem recentemente ser preparados no dia onde a biblioteca é preparada. Similarmente, as enzimas usadas na preparação da biblioteca tendem a ter taxas altas da degradação na temperatura ambiente, que os meios eles precisam de ser armazenados consistentemente em temperaturas apropriadas para assegurar a eficiência da reacção.

A preparação da biblioteca deve ser precedida pela quantificação do ADN. Recomenda-se que esta quantificação está feita usando um fluorímetro porque as técnicas que usam tinturas intercalando para a quantificação do ADN têm uma precisão mais alta e a sensibilidade melhorada comparadas aos espectrómetros. A preparação da biblioteca deve ser precedida e seguido pela verificação da distribuição de tamanho da amostra, usando máquinas do bioanalyzer.

É importante usar um jogo do ADN da sensibilidade alta para garantir que a quantificação e a qualificação do ADN são exactas. Os adaptadores usados na preparação da biblioteca adicionarão o peso à amostra e devem ser levados em consideração durante a selecção de tamanho.

Antes de arranjar em seqüência, as bibliotecas na preparação devem ser limpadas e tamanho ser seleccionadas para remover os fragmentos indesejados do ADN, por exemplo as primeiras demão que não ligaram ou os dímero da primeira demão. O ADN limpa deve igualmente eliminar todos os fragmentos do ADN que estiverem abaixo de 200 bp de comprimento.

Antes da síntese da biblioteca, recomenda-se que o ADN immunoprecipitated esteja analisado. Isto é feito usando o qPCR com um mínimo de um alvo positivo e negativo do controle para um gene específico escolhido conforme a exigência.

Microplaqueta-segs. exige um controle comparar picos da análise da seqüência, e conseqüentemente os controles devem ser preparados ao lado da biblioteca. Quando nenhum controle for concordado universal como óptimo, os mais comuns no uso um do seguinte:

  • Entre o ADN, ou o ADN que não immunoprecipitated
  • Zombe o ADN, ou o ADN que não é tratado com um anticorpo durante a imunoprecipitação
  • Não específico, ou um anticorpo que seja sabido para não interagir com o ADN

Como anticorpos Microplaqueta-segs.s dos usos, as experiências podem ser restringidas pelo uso do anticorpo. A melhor biblioteca será construída usando um anticorpo validado, porque alguns anticorpos não são compatíveis com a próxima geração que arranja em seqüência plataformas.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Feb 26, 2019

Sara Ryding

Written by

Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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