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preparación Viruta-seq de la biblioteca

Es posible perfilar las proteínas, las modificaciones de la histona, y los nucleosomes DNA-obligatorios de un genoma entero usando la inmunoprecipitación de la cromatina seguida ordenando, o Viruta-seq. La preparación de una biblioteca Viruta-seq permite el estudio de la regla del gen y de mecanismos epigenéticos.

Ejemplo de célulasAlexander Mozymov | Shutterstock

Preparación acertada de la biblioteca

La preparación estándar de la biblioteca de la DNA no es disímil a la preparación Viruta-seq de la biblioteca. Varios métodos comerciales existen, adaptado a menudo para la generación siguiente que ordena Illumina llamado plataforma que ordena, que se puede también utilizar en la preparación estándar de la biblioteca de la DNA. La otra generación siguiente que ordena las plataformas incluye Helicos, Roche, y ABI. Una diferencia entre la preparación estándar y Viruta-seq de la biblioteca es la cantidad de DNA de la entrada, que es común más inferior para las bibliotecas Viruta-seq.

Toda la viruta experimenta foco en las proteínas que atan la DNA, así que comienza reticulando las proteínas DNA-obligatorias a la DNA. Esto se hace típicamente usando el formaldehido, seguido por el corte sonicación-inducido. Esto rinde pequeños fragmentos en el rango del punto de ebullición 200 a 600. Un anticuerpo aumentado contra la proteína apuntada se utiliza al immunoprecipitate el complejo de la DNA y de la proteína. Las reticulaciones entonces se invierten, y la DNA libre hecha fragmentos se utiliza en la preparación de la biblioteca.   

La preparación de la biblioteca para Illumina sigue a menudo el mismo contorno general. La entrada, consistiendo en la DNA hecha fragmentos, experimenta el tratamiento para reparar los extremos y el fosforilato el extremo primero 5. Después de esto, se liga el adaptador elegido y la pieza del uracilo de este adaptador se recorta. La polimerización en cadena se utiliza para el enriquecimiento y la duplicación del cabo, se limpian los productos y se construye la biblioteca.

Recomendaciones para la preparación de la biblioteca

Para construir las bibliotecas que tienen buen abrigo y polarización negativa inferior, la DNA de alta calidad y preparación apropiada de la biblioteca sea necesario. Durante la preparación, la recuperación de la muestra se puede maximizar usando los tubos inferiores de la retención que disminuyen el atascamiento de la DNA a las mercancías del plástico del laboratorio.

Todos los reactivos deben ser recién preparados en el día que se prepara la biblioteca. Semejantemente, las enzimas usadas en la preparación de la biblioteca tienden a tener altos regímenes de la degradación en la temperatura ambiente, que los medios ellos necesitan ser salvados constantemente en las temperaturas convenientes para asegurar eficiencia de la reacción.

La preparación de la biblioteca se debe preceder por la cuantificación de la DNA. Se recomienda que esta cuantificación está hecha usando un fluorómetro porque las técnicas que utilizan los tintes de intercalación para la cuantificación de la DNA tienen una exactitud más alta y sensibilidad perfeccionada comparadas a los espectrómetros. La preparación de la biblioteca se debe preceder y seguir por la verificación de la distribución del tamaño de muestra, usando las máquinas del bioanalyzer.

Es importante utilizar un estuche de la DNA de la alta sensibilidad para garantizar que la cuantificación y la aptitud de la DNA es exactas. Los adaptadores usados en la preparación de la biblioteca agregarán el peso a la muestra y se deben tener en cuenta durante la selección de talla.

Antes de la secuencia, las bibliotecas en la preparación se deben ser limpiadas y talla seleccionar para quitar fragmentos indeseados de la DNA, por ejemplo las pinturas de fondo que no han ligado o los dimeros de la pintura de fondo. La DNA limpia debe también eliminar cualquier fragmento de la DNA que esté abajo del punto de ebullición 200 de largo.

Antes de la síntesis de la biblioteca, se aconseja que la DNA immunoprecipitated esté analizada. Esto se hace usando qPCR con una condición atmosférica mínima un objetivo positivo y negativo del mando para un gen específico elegido según el requisito.

Viruta-seq requiere un mando comparar picos del análisis de la serie, y por lo tanto los mandos se deben preparar junto a la biblioteca. Mientras que no se conviene en ningún mando universal como el óptimo, los mas comunes el funcionando del siguiente:

  • Entre la DNA, o la DNA que no immunoprecipitated
  • Imite la DNA, o la DNA que no se trata con un anticuerpo durante la inmunoprecipitación
  • No específico, o un anticuerpo que se sabe para no obrar recíprocamente con la DNA

Como anticuerpos Viruta-seq de las aplicaciones, los experimentos se pueden restringir por uso del anticuerpo. La mejor biblioteca será construida usando un anticuerpo validado, pues algunos anticuerpos no son compatibles con la generación siguiente que ordena las plataformas.

Fuentes

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Last Updated: Feb 26, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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