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Selecção dos media da cromatografia

A cromatografia é uma técnica que seja usada para a separação de misturas. O nome combina o croma grego da palavra, ou a “cor,” com o graphein, “para escrever.” A técnica foi inventada em 1900 por Mikhail Tsvet, que a usou “para escrever as cores” de pigmentos da planta, como carotenos da clorofila e xanthophylls. Fez este dissolvendo as misturas da planta em um líquido, ou a fase móvel, e permitindo que corra através de um material contínuo chamou uma fase estacionária.

Os componentes da mistura a ser separada correm através do material da fase estacionária em taxas diferentes, que cria ondas ou faixas. Originalmente, aquelas faixas foram detectadas por diferenças visíveis da cor. Os métodos de detecção são baseados agora nas propriedades químicas e físicas das moléculas que estão sendo separados, incluindo, mas não limitadas para colorir, da absorvência, do tamanho, da carga, e do hydrophobicity UV.

Em separações cromatográficas modernas, a fase estacionária vem sob a forma dos media, pre-embalados em uma coluna de cromatografia ou adicionados pelo usuário ao instrumento da separação. A escolha dos media depende do tipo de molécula que está sendo separada, os meios da separação, a finalidade e a escala da separação, assim como a pureza desejada da amostra separada.

Geralmente, o material usado em media da cromatografia é uma partícula ou uma resina embalada em uma coluna. A amostra é carregada na parte superior da coluna e nivelada completamente com o líquido da fase móvel, gravidade ou sob a pressão. A cromatografia pode ser realizada em uma pequena escala para finalidades analíticas ou em uma media-à-grande escala para a preparação e finalidades industriais.

Cromatografia da troca iónica

Um dos métodos os mais populares para separar proteínas é cromatografia da troca iónica. Separa proteínas em uma amostra baseada na carga. Se da as moléculas cobradas negativamente - a resina cobrada está usada para capturar positivamente -, o método são referidas como a cromatografia da troca de cation.

O oposto, em que a resina positivamente - cobrado e a molécula do alvo é negativamente - é cobrada, é chamado cromatografia da troca de aníon. Uma resina da troca iónica é feita usando-se positivamente ou negativamente - grupos funcionais cobrados em uma matriz contínua como a celulose, o agarose ou o polyacrylamide. Uma amostra da proteína é carregada na coluna em um amortecedor do baixo sal e nivelada então através da coluna com um inclinação da concentração de sal ou da mudança no pH.

Cromatografia da exclusão do tamanho

Uma propriedade física simples e surpreendentemente eficaz que possa ser usada para separações cromatográficas é tamanho. Em tamanho a cromatografia da exclusão (SEC), a amostra é filtrada através de um gel feito de grânulos esféricos com poros específico-feitos sob medida.

Estes poros incluem ou excluem as proteínas que correm através na fase móvel. Este método é de uso geral para a separação de proteínas. As moléculas demasiado grandes para entrar nos poros correrão através rapidamente, e as moléculas que entram nos poros serão retardadas e para passar mais lentamente através da coluna. O segundo é usado frequentemente como uma etapa adiantada em purificação da proteína, como antes de uma separação da troca iónica e para dessalinizar uma amostra ou para trocar amortecedores.

Cromatografia de afinidade

A cromatografia de afinidade é baseada em interacções obrigatórias entre uma proteína e uma ligante imobilizadas a uma resina. Estes interacções obrigatórias são altamente selectivos. Uma separação da afinidade é uma separação muito precisa e capturará quase sempre somente uma proteína em uma mistura.

A cromatografia de afinidade pode ser usada como um método de uma etapa da purificação, em algumas circunstâncias, conseguindo uma purificação de maior de 1000 dobras de uma proteína específica. O material da resina para uma coluna de afinidade pode ser contínuo ou um material poroso do gel. Uma vasta gama de materiais foi usada como um material de matriz contínuo para a cromatografia de afinidade, incluindo o agarose, a celulose, o dextrano, o polyacrylamide, e o muito mais.

As matrizes porosas do gel para colunas de afinidade são particularmente atractivas, porque o formato do micro-grânulo permite que sejam dispensadas como uma pasta molhada e embaladas em colunas de todo o tamanho. Os media da afinidade para ligar classes gerais de proteínas ou proteínas com as etiquetas comuns da fusão estão disponíveis comercialmente. As ligantes mais especializadas podem ser acopladas aos produtos de matriz ativados disponíveis no comércio da afinidade.

Quando a troca iónica, fizer sob medida a exclusão e media da cromatografia de afinidade é algumas das opções as mais populares e as mais de uso geral, há umas dúzias de outros métodos. Estes incluem a cromatografia hidrofóbica da interacção, invertida - põe em fase a cromatografia, a cromatografia bidimensional e a muita outro que são usadas para explorar e conseguir a separação perfeita.

Fontes

  1. Clorofila do über DAS de Mikhail Tswett (1906) “Physikalisch-Chemische Studien. Morre a adsorção.” (Estudos físicos-químicos da clorofila. O der Deutschen de Berichte da adsorção.) botanischen o Gesellschaft, Vol. 24, pp. 316-326.
  2. Pontas do banco: Pontas em selecionar uma resina da cromatografia líquida, http://www.biocompare.com/Bench-Tips/179929-Tips-on-Selecting-a-Liquid-Chromatography-Resin/
  3. Cromatografia da troca iónica, http://www.proteinchemist.com/tutorial/iec.html
  4. Vista geral da purificação da afinidade, https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-affinity-purification.html

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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