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Dépistage de méthylation d'ADN

La méthylation d'ADN est l'une des modifications les plus importantes en cellules mammifères qui joue un rôle essentiel dans l'accroissement de réglementation des cellules et de leur prolifération. Chez l'homme, elle se rapporte à l'ajout d'un groupe méthylique à la position de 5 carbones de la cytosine (5-methylcytosine ou 5   mètre-bougie), qui se produit exclusivement aux sites symétriques de CG. sur la double helice d'ADN - dinucléotides également nommés de CpG.

Le dépistage des configurations de méthylation d'ADN est un domaine de recherche rapidement de avancement, avec des promesses la possibilité de la méthylation profilant pour discerner la tumeur variée et les types de cancer, et probablement leur réaction aux agents chimiothérapeutiques. Le dépistage des aberrancies de la méthylation d'ADN semble être l'un des tests les plus significatifs dans le diagnostic tôt de cancer.

Beaucoup de techniques développées pour le dépistage de la méthylation d'ADN peuvent être divisées en trois groupes : modification chimique avec du bisulfite (représenté par l'ordonnancement génomique de bisulfite), la digestion d'enzymes de restriction (représentée par les endonucléases méthylation-sensibles de restriction) et l'isolement basé sur affinité de l'ADN méthylé (représenté par immunoprécipitation méthylée d'ADN).

Ordonnancement génomique de bisulfite

La technologie de ordonnancement génomique de bisulfite est considérée comme un étalon-or dans le domaine pour le dépistage de la méthylation d'ADN dû à son approche quantitative, qualitative et efficace pour indiquer exactement le methylcytosine 5 à la définition unique de paire de bases. Cette technique permet la différenciation de méthyler de l'ADN unmethylated par l'intermédiaire de l'amplification d'ACP et de l'analyse suivante des produits d'ACP.

L'ACP est une méthode employée pour amplifier les parties sélectées d'ADN pour l'analyse. Pendant l'amplification d'ACP dans l'ordonnancement génomique de bisulfite, les cytosines unmethylated amplifient comme thymines, alors que les cytosines méthylés amplifient comme cytosine. L'état de méthylation peut être alors déterminé par le produit direct d'ACP ordonnançant (où l'état moyen de méthylation est trouvé) ou ordonnancement de sous-clonage (quand la distribution unique de molécules des configurations de méthylation est trouvée).

La plupart des méthodes pour analyser la méthylation d'ADN aux lieux spécifiques d'intérêt sont basées sur cette approche. Les techniques importantes qui fonctionnent sur la base du bisulfite sont analyse combinée de restriction de bisulfite (COBRA), ACP de détail de méthylation (MSP) et prolonge unique Méthylation-sensible d'amorce de nucléotide (Mme-SNuPE). Des modifications nombreuses du protocole de ordonnancement génomique de bisulfite ont été explorées pour optimiser le résultat final et pour améliorer l'exactitude générale de cette procédure.

endonucléases Méthylation-sensibles de restriction

les endonucléases Méthylation-sensibles de restriction représentent les outils classiques de l'analyse de méthylation d'ADN. Les méthodes qui les utilisent enrichissent pour l'ADN méthylé ou l'ADN unmethylated. La capacité d'enrichir unmethylated l'ADN - en assimilant l'ADN méthylé ou en isolant de plus petits éclats produits par les enzymes méthylation-inhibées - est particulièrement utile pour analyser important, génomes fortement méthylés.

Le plus souvent les enzymes utilisées de restriction sont les paires d'enzymes de restriction (aussi isoschizomers appelés) HpaII et MspI, qui identifient la séquence CCGG. HpaII est bloqué par méthylation de l'un ou l'autre des deux cytosines, alors que MspI est bloqué par méthylation simplement de la cytosine extérieure. En génomes mammifères, où la méthylation est liée presque exclusivement aux sites de CG., HpaII est empêché et MspI n'est pas.

Plus de 60% du CG. des sites sont méthylés dans le génome humain, par conséquent enrichir l'ADN unmethylated réduit une complexité de l'échantillon de manière significative. La procédure elle-même semble être plus simple et plus rapidement que l'ordonnancement génomique de bisulfite. La limitation importante partagée par toutes les techniques basées sur les endonucléases méthylation-sensibles de restriction est l'analyse de la méthylation seulement dans des sites de reconnaissance.

Immunoprécipitation méthylée d'ADN

L'immunoprécipitation méthylée d'ADN (MeDIP) est une technique efficace pour l'extraction de l'ADN méthylé d'un échantillon d'intérêt. De cette procédure l'ADN génomique est soniqué dans des éclats et immunoprecipitated avec les anticorps monoclonaux (anticorps produits par un clone unique des cellules) qui identifient particulièrement le methylcytidine 5.

La limite méthylée d'ADN au composé d'anticorps est alors séparée du reste de l'ADN par un aimant utilisé pour tirer les composés hors d'une solution. Après isolement et purification est exécuté, l'ADN méthylé est prêt pour n'importe quel lieu-détail (ACP) ou (ordonnancement et puce ADN) études de la taille du génome de méthylation. La technique fournit à une vue rapide des niveaux de méthylation d'ADN seulement une quantité limitée d'ADN commençant.

Bien que MeDIP soit plus rapide que le bisulfite traditionnel ordonnançant des méthodes et non limité à l'analyse des séquences spécifiques comme dans l'analyse de l'enzyme de restriction, l'immunoprécipitation dépend de la séquence d'ADN (densité y compris de CpG), de la présence des éléments répétitifs et de la composition. Ainsi, les contrôles appropriés sont nécessaires pour l'analyse et l'évaluation des résultats obtenus.

Sources

  1. http://people.umass.edu/braunlab/DNAmeth_methodreview2007.pdf
  2. http://nar.oxfordjournals.org/content/33/14/e124.full
  3. http://dev.biologists.org/content/134/22/3959.full.pdf
  4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2763296/
  5. http://www3.imperial.ac.uk/bioinspiredtechnology/research/dnamethylation

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Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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