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Rilevazione di metilazione del DNA

La metilazione del DNA è una delle modifiche più importanti in cellule di mammiferi che svolge un ruolo essenziale nella crescita di regolamentazione delle celle e della loro proliferazione. In esseri umani, si riferisce all'aggiunta di un gruppo metilico alla posizione di 5 carboni di citosina (5-methylcytosine o 5   mC), che accade esclusivamente ai siti simmetrici sulla doppia elica del DNA - dinucleotidi anche definiti di CG di CpG.

La rilevazione dei reticoli di metilazione del DNA è un campo di ricerca rapido d'avanzamento, con le promesse la possibilità della metilazione che profila per distinguere i vari tipi del cancro e del tumore e possibilmente la loro risposta agli agenti chemioterapeutici. La rilevazione dei aberrancies di metilazione del DNA sembra essere una delle prove più significative nella diagnosi iniziale del cancro.

Molte tecniche sviluppate per rilevazione di metilazione del DNA possono essere divise in tre gruppi: modifica chimica con bisolfuro (rappresentato dall'ordinamento genomica del bisolfuro), digestione degli enzimi di restrizione (rappresentata agli dagli endonucleasi metilazione sensibili di restrizione) e ad isolamento basato a affinità di DNA metilato (rappresentato da immunoprecipitazione metilata del DNA).

Ordinamento genomica del bisolfuro

La tecnologia d'ordinamento genomica del bisolfuro è considerare come uno d'oro standard nel campo per rilevazione di metilazione del DNA dovuto il suo approccio quantitativo, qualitativo ed efficiente per segnare il methylcytosine con esattezza 5 a singola risoluzione della coppia di basi. Questa tecnica permette la differenziazione del metilato di da DNA unmethylated via l'amplificazione di PCR e l'analisi successiva dei prodotti di PCR.

La PCR è un metodo impiegato per ampliare le sezioni selezionate di DNA per l'analisi. Durante l'amplificazione di PCR nell'ordinamento genomica del bisolfuro, i cytosines unmethylated ampliano come timine, mentre i cytosines metilati ampliano come citosina. Lo stato di metilazione può poi essere determinato attraverso il prodotto diretto di PCR che ordina (dove lo stato medio di metilazione è individuato) o ordinamento della sotto-clonazione (quando la distribuzione singola delle molecole dei reticoli di metilazione è individuata).

La maggior parte dei metodi per analizzare la metilazione del DNA ai luoghi specifici di interesse sono basati su questo approccio. Le tecniche prominenti che funzionano in base a bisolfuro sono PCR specifica combinata dell'analisi (COBRA), di metilazione della restrizione del bisolfuro (MSP) ed a singola estensione Metilazione sensibile della mano di fondo del nucleotide (Sig.ra-SNuPE). Le numerose modifiche del protocollo d'ordinamento genomica del bisolfuro sono state esplorate per ottimizzare il risultato finale e per migliorare l'accuratezza globale di questa procedura.

ad endonucleasi Metilazione sensibili di restrizione

ad endonucleasi Metilazione sensibili della restrizione rappresentano gli strumenti classici dell'analisi di metilazione del DNA. I metodi che li impiegano arricchiscono per DNA metilato o DNA unmethylated. La capacità di arricchire unmethylated il DNA - digerendo DNA metilato o isolando i più piccoli frammenti generati dagli enzimi metilazione-inibiti - è particolarmente utile per analizzare importante, genoma molto metilati.

Il più delle volte gli enzimi usati della restrizione sono le paia degli enzimi della restrizione (anche chiamate isoschizomers) HpaII e MspI, che riconoscono la sequenza CCGG. HpaII è bloccato da metilazione dell'uno o l'altro dei due cytosines, mentre MspI è bloccato da metilazione soltanto della citosina esterna. In genoma mammiferi, in cui la metilazione è collegata quasi esclusivamente ai siti di CG, HpaII è inibito e MspI non è.

Più di 60% del CG i siti sono metilati all'interno del genoma umano, quindi arricchire il DNA unmethylated diminuisce significativamente una complessità del campione. La procedura stessa sembra essere più semplice e più velocemente dell'ordinamento genomica del bisolfuro. La limitazione importante compartecipe mediante tutte le tecniche basate agli sugli endonucleasi metilazione sensibili della restrizione è l'analisi di metilazione soltanto all'interno dei siti di riconoscimento.

Immunoprecipitazione metilata del DNA

L'immunoprecipitazione metilata del DNA (MeDIP) è una tecnica efficiente per l'estrazione di DNA metilato da un campione di interesse. In questa procedura DNA genomico è sonicato nei frammenti e immunoprecipitated con gli anticorpi monoclonali (anticorpi prodotti da un singolo clone delle celle) che specificamente riconoscono il methylcytidine 5.

Il limite metilato del DNA al complesso dell'anticorpo poi è separato dal resto del DNA da un magnete utilizzato per tirare i complessi da una soluzione. Dopo isolamento e depurazione è eseguito, il DNA metilato è pronto per tutti gli (ordinare e microarray) studi luogo-specifici (PCR) o genoma di ampiezza di metilazione. La tecnica fornisce una visualizzazione rapida dei livelli di metilazione del DNA soltanto una quantità limitata di iniziare il DNA.

Sebbene MeDIP sia più veloce del bisolfuro tradizionale che ordina i metodi e non limitato all'analisi delle sequenze specifiche come nell'analisi dell'enzima della restrizione, l'immunoprecipitazione dipende dalla sequenza del DNA (densità compresa di CpG), dalla presenza di elementi ripetitivi e dalla composizione. Quindi, i comandi appropriati sono necessari per l'analisi e l'interpretazione dei risultati ottenuti.

Sorgenti

  1. http://people.umass.edu/braunlab/DNAmeth_methodreview2007.pdf
  2. http://nar.oxfordjournals.org/content/33/14/e124.full
  3. http://dev.biologists.org/content/134/22/3959.full.pdf
  4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2763296/
  5. http://www3.imperial.ac.uk/bioinspiredtechnology/research/dnamethylation

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Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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