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Detecção do Methylation do ADN

O methylation do ADN é uma das alterações as mais importantes em pilhas mamíferas que joga um papel essencial no crescimento de regulamento das pilhas e de sua proliferação. Nos seres humanos, refere a adição de um grupo metílico na posição de 5 carbonos do cytosine (5-methylcytosine ou 5   mC), que acontece exclusivamente em locais simétricos na hélice dobro do ADN - dinucleotides igualmente denominados do CG de CpG.

A detecção de testes padrões do methylation do ADN é uma área de pesquisa ràpida de avanço, com promessas a possibilidade do methylation que perfila para distinguir vários tipos do tumor e do cancro, e possivelmente sua resposta aos agentes quimioterapêuticos. A detecção de aberrancies do methylation do ADN parece ser um dos testes os mais significativos no diagnóstico adiantado do cancro.

Muitas técnicas desenvolvidas para a detecção de methylation do ADN podem ser divididas em três grupos: alteração química com o bissulfito (representado arranjar em seqüência genomic do bissulfito), a digestão da enzima da limitação (representada por endonucleases methylation-sensíveis da limitação) e isolamento afinidade-baseado do ADN misturado (representado pela imunoprecipitação misturada do ADN).

Arranjar em seqüência genomic do bissulfito

A tecnologia arranjando em seqüência genomic do bissulfito é considerada como uma bandeira de ouro no campo para a detecção de methylation do ADN devido a sua aproximação quantitativa, qualitativa e eficiente para localizar o methylcytosine 5 na única definição dos base-pares. Esta técnica permite a diferenciação do misturado do ADN unmethylated através da amplificação do PCR e da análise subseqüente dos produtos do PCR.

O PCR é um método usado para amplificar secções selecionadas do ADN para a análise. Durante a amplificação do PCR em arranjar em seqüência genomic do bissulfito, os cytosines unmethylated amplificam como o thymine, quando os cytosines misturados amplificarem como o cytosine. O estado do methylation pode então ser determinado através do produto directo do PCR que arranja em seqüência (onde o estado médio do methylation é detectado) ou arranjar em seqüência da secundário-clonagem (quando a única distribuição das moléculas de testes padrões do methylation for detectada).

A maioria de métodos para analisar o methylation do ADN nos locus específicos do interesse são baseados nesta aproximação. As técnicas proeminentes que trabalham com base no bissulfito são PCR específico combinado da análise (COBRA), do Methylation da limitação do bissulfito (MSP) e única extensão Methylation-sensível da primeira demão do Nucleotide (Senhora-SNuPE). As alterações numerosas do protocolo arranjando em seqüência genomic do bissulfito foram exploradas para aperfeiçoar o resultado final e para melhorar a precisão total deste procedimento.

endonucleases Methylation-sensíveis da limitação

os endonucleases Methylation-sensíveis da limitação representam ferramentas clássicas da análise do methylation do ADN. Os métodos que os empregam enriquecem para o ADN misturado ou o ADN unmethylated. A capacidade para enriquecer unmethylated o ADN - digerindo o ADN misturado ou isolando os fragmentos menores gerados por enzimas methylation-inibidas - é particularmente útil para analisar importante, genomas pesadamente misturados.

Mais frequentemente as enzimas usadas da limitação são os pares da enzima da limitação (igualmente chamados isoschizomers) HpaII e MspI, que reconhecem a seqüência CCGG. HpaII é obstruído pelo methylation de qualquer um dos dois cytosines, visto que MspI é obstruído pelo methylation meramente do cytosine exterior. Nos genomas mamíferos, onde o methylation é ligado quase exclusivamente aos locais do CG, HpaII é inibido e MspI não é.

Sobre 60% do CG os locais são misturados dentro do genoma humano, daqui enriquecer o ADN unmethylated reduz uma complexidade da amostra significativamente. O procedimento próprio parece ser mais simples e mais rapidamente do que arranjar em seqüência genomic do bissulfito. A limitação importante compartilhada por todas as técnicas baseadas em endonucleases methylation-sensíveis da limitação é a análise do methylation somente dentro dos locais de reconhecimento.

Imunoprecipitação misturada do ADN

A imunoprecipitação misturada do ADN (MeDIP) é uma técnica eficiente para a extracção do ADN misturado de uma amostra de interesse. Neste procedimento o ADN genomic sonicated em fragmentos e immunoprecipitated com os anticorpos monoclonais (anticorpos produzidos por um único clone das pilhas) que reconhecem especificamente o methylcytidine 5.

O limite misturado do ADN ao complexo do anticorpo é separado então do resto do ADN por um ímã usado para puxar os complexos fora de uma solução. Após o isolamento e a purificação é executado, o ADN misturado está pronto para todos os (arranjar em seqüência e microarray) estudos locus-específicos (PCR) ou genoma-largos do methylation. A técnica fornece uma ideia rápida de níveis do methylation do ADN somente uma quantidade limitada de começar o ADN.

Embora MeDIP seja mais rápido do que o bissulfito tradicional que arranja em seqüência métodos e não limitado à análise de seqüências específicas como na análise de enzima da limitação, a imunoprecipitação é dependente da seqüência do ADN (que incluem a densidade de CpG), da presença de elementos repetitivos e da composição. Assim, os controles apropriados são necessários para a análise e a interpretação de resultados obtidos.

Fontes

  1. http://people.umass.edu/braunlab/DNAmeth_methodreview2007.pdf
  2. http://nar.oxfordjournals.org/content/33/14/e124.full
  3. http://dev.biologists.org/content/134/22/3959.full.pdf
  4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2763296/
  5. http://www3.imperial.ac.uk/bioinspiredtechnology/research/dnamethylation

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Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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