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Detección de la metilación de la DNA

La metilación de la DNA es una de las modificaciones más importantes de células mamíferas que desempeña un papel esencial en el incremento de regulación de las células y de su proliferación. En seres humanos, refiere a la adición de un grupo metílico en la posición de 5 carbonos de la citosina (5-methylcytosine o 5 el   bujía métrica), que suceso exclusivamente en los sitios simétricos en el doble hélice de la DNA - dinucleótidos también llamados del CG de CpG.

La detección de las configuraciones de la metilación de la DNA es un campo de investigación rápidamente de avance, con promesas la posibilidad de la metilación que perfila para distinguir diversos tipos del tumor y del cáncer, y posiblemente su reacción a los agentes quimioterapéuticos. La detección de aberrancies de la metilación de la DNA aparece ser una de las pruebas más importantes de la diagnosis temprana del cáncer.

Muchas técnicas desarrolladas para la detección de la metilación de la DNA se pueden dividir en tres grupos: modificación química con el bisulfito (representado por la secuencia genomic del bisulfito), la digestión de la enzima de la restricción (representada por los endonucleases metilación-sensibles de la restricción) y el aislamiento afinidad-basado de la DNA desnaturalizada (representada por la inmunoprecipitación desnaturalizada de la DNA).

Secuencia genomic del bisulfito

La tecnología de secuencia genomic del bisulfito se mira como oro-estándar en el campo para la detección de la metilación de la DNA debido a su aproximación cuantitativa, cualitativa y eficiente para establecer claramente el methylcytosine 5 en la única resolución de los base-pares. Esta técnica permite la diferenciación de desnaturalizado de la DNA unmethylated vía la amplificación de la polimerización en cadena y el análisis subsiguiente de los productos de la polimerización en cadena.

La polimerización en cadena es un método usado para amplificar secciones seleccionadas de la DNA para el análisis. Durante la amplificación de la polimerización en cadena en la secuencia genomic del bisulfito, los cytosines unmethylated amplifican como thymine, mientras que los cytosines desnaturalizados amplifican como citosina. El estado de la metilación se puede entonces determinar a través del producto directo de la polimerización en cadena que ordena (donde se descubre el estado medio de la metilación) o secuencia de la sub-reproducción (cuando la única distribución de las moléculas de las configuraciones de la metilación se descubre).

La mayoría de los métodos para analizar la metilación de la DNA en los lugares geométricos específicos del interés se basan en esta aproximación. Las técnicas prominentes que trabajan en base del bisulfito son polimerización en cadena específica combinada y única extensión Metilación-sensible de la pintura de fondo del nucleótido (Ms-SNuPE (MSP)) del análisis (COBRA), de la metilación de la restricción del bisulfito. Las modificaciones numerosas del protocolo de secuencia genomic del bisulfito se han explorado para optimizar el resultado final y para perfeccionar exactitud total de este procedimiento.

endonucleases Metilación-sensibles de la restricción

los endonucleases Metilación-sensibles de la restricción representan las herramientas clásicas del análisis de la metilación de la DNA. Los métodos que los emplean enriquecen para la DNA desnaturalizada o la DNA unmethylated. La capacidad de enriquecer unmethylated la DNA - digiriendo la DNA desnaturalizada o aislando fragmentos más pequeños generados por las enzimas metilación-inhibidas - es determinado útil para analizar importante, genomas pesado desnaturalizados.

Lo más frecuentemente las enzimas usadas de la restricción son los pares de la enzima de la restricción (también llamados los isoschizomers) HpaII y MspI, que reconocen la serie CCGG. HpaII es cegado por la metilación de cualquiera de los dos cytosines, mientras que MspI es cegado por la metilación simplemente de la citosina exterior. En los genomas mamíferos, donde la metilación se conecta casi exclusivamente a los sitios del CG, se inhibe HpaII y MspI no es.

Sobre el 60% del CG los sitios se desnaturalizan dentro del genoma humano, por lo tanto el enriquecimiento de la DNA unmethylated reduce una complejidad de la muestra importante. El procedimiento sí mismo parece ser más simple y más rápidamente que la secuencia genomic del bisulfito. La limitación importante compartida por todas las técnicas basadas en los endonucleases metilación-sensibles de la restricción es el análisis de la metilación solamente dentro de sitios de reconocimiento.

Inmunoprecipitación desnaturalizada de la DNA

La inmunoprecipitación desnaturalizada de la DNA (MeDIP) es una técnica eficiente para la extracción de la DNA desnaturalizada de una muestra del interés. En este procedimiento la DNA genomic se sonoriza en fragmentos e immunoprecipitated con los anticuerpos monoclonales (anticuerpos producidos por una única copia de células) que reconocen específicamente el methylcytidine 5.

El salto desnaturalizado de la DNA al complejo del anticuerpo entonces es separado del descanso de la DNA por un imán usado para sacar de los complejos una solución. Después del aislamiento y de la purificación se realiza, la DNA desnaturalizada está lista para cualquier (secuencia y microarray) estudio lugar-específico (polimerización en cadena) o genoma-ancho de la metilación. La técnica provee de una vista rápida de los niveles de la metilación de la DNA solamente una cantidad limitada de comenzar la DNA.

Aunque MeDIP sea más rápido que el bisulfito tradicional que ordena métodos y no limitado al análisis de series específicas como en el análisis enzimático de la restricción, la inmunoprecipitación es relacionada en serie de la DNA (densidad incluyendo de CpG), la presencia de elementos repetidores y la composición. Así, los mandos apropiados son necesarios para el análisis y la interpretación de resultados obtenidos.

Fuentes

  1. http://people.umass.edu/braunlab/DNAmeth_methodreview2007.pdf
  2. http://nar.oxfordjournals.org/content/33/14/e124.full
  3. http://dev.biologists.org/content/134/22/3959.full.pdf
  4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2763296/
  5. http://www3.imperial.ac.uk/bioinspiredtechnology/research/dnamethylation

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Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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