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Rilevazione dell'aneuploide facendo uso di citometria a flusso

L'aneuploide è definito come aberrazione cromosomica che comprende un'aggiunta o l'eliminazione dei cromosomi confrontati al numero “normale„ di 46 cromosomi. La citometria a flusso è uno strumento utile per la rilevazione anueploidy.  

Sindrome di Down è causata da aneuploide del cromosoma 21Media medici di Alila | Shutterstock

Perché citometria a flusso?

Tradizionalmente, l'aneuploide è stato diagnosticato contando i cromosomi di metafase sotto il microscopio. Tuttavia, in molti casi e soprattutto dovuto l'alto o numero più basso dei cromosomi, era difficile da ottenere un conteggio preciso. Inoltre, il metodo comprende molto tempo e manipolazione di forti acidi, che lo rende inadatto per uso su grande scala.

La citometria a flusso sorpassa gli svantaggi suddetti poiché quantifica la quantità di DNA piuttosto il conteggio del numero dei cromosomi. Inoltre, dovuto la natura autonoma del metodo, non c'è interazione con i solventi pericolosi.

La citometria a flusso è una tecnica accurata e affidabile

L'accuratezza di citometria a flusso è conforme alle seguenti circostanze: a basso livello del coefficiente di variazione dei picchi del DNA, di una percentuale uguale di celle in ogni picco e di piccola differenza in DNA del campione e del riferimento interno.

Per esempio, se il picco del DNA nel riferimento interno alza a 100, il picco del DNA dai campioni dovrebbe trovarsi nell'ordine +/- di 50 dal picco di riferimento. Le posizioni medie dovrebbero essere definite per sia i picchi di campione che di riferimento. Il rapporto standard è costante e si riferisce al rapporto del picco di campione e del picco di riferimento.

Citometria a flusso per individuare aneuploide nei campioni di pianta

Nei campioni di pianta, la venatura di una foglia aperta è tagliata facendo uso di un rasoio nella capsula di Petri che consiste dell'acido citrico e del Tween 20. Il campione può essere filtrato facendo uso di una maglia di nylon. Lo standard di riferimento interno, quali i nuclei (RBC) di globulo rosso e la macchia nucleare si aggiungono al buffer.

Il contenuto del DNA è determinato confrontando i nuclei del riferimento interno ed i nuclei del campione ed intorno 5000-10000 nuclei sono analizzati per ottenere una media. Tuttavia, in determinati casi, tutti i cromosomi non possono avere lo stesso numero, che può potenzialmente piombo alle complicazioni nell'analisi di citometria a flusso.

Citometria a flusso per individuare aneuploide nei cancri

La citometria a flusso egualmente è stata eseguita per individuare le aberrazioni nel numero di cromosoma nel piccolo carcinoma umano del polmone delle cellule. In questo caso, due o tre sezioni del tessuto che erano circa 50 micrometri ampi dewaxed in xilene, sono state sottoposte alla reidratazione in etanolo e poi sono state lavate in acqua distillata.

I tessuti sono stati trattati con citrato e pepsina per ottenere le sospensioni unicellulari. Questi poi sono stati filtrati nella maglia di nylon e sono stati lavati. I nuclei dissociati sono stati macchiati per i nuclei facendo uso dello ioduro di propidium. Questi nuclei poi sono stati sottoposti a citometria a flusso e sono stati analizzati facendo uso del software di ModFit.

Analizzare i dati

Nei casi in cui il coefficiente di variazione supera 10%, gli istogrammi sono eliminati e non sono usati per l'analisi definitiva. Il campione è considerato diploide nei casi in cui c'è un singolo e picco separato nella fase G0/G1. Gli istogrammi che erano tetraploidi o il multiploid sono classificati come aneuploid.

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Last Updated: Mar 28, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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