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Detectando o Aneuploidy usando o Cytometry de fluxo

O Aneuploidy é definido como uma aberração cromossomática que envolve uma adição ou o supressão dos cromossomas comparados ao número “normal” de 46 cromossomas. O cytometry de fluxo é uma ferramenta útil para detectar anueploidy.  

Síndrome de Down é causada pelo aneuploidy do cromossoma 21Media médicos de Alila | Shutterstock

Por que cytometry de fluxo?

Tradicional, o aneuploidy foi diagnosticado contando os cromossomas da metafase sob o microscópio. Contudo, em muitos casos, e primeiramente devido ao número alto ou mais baixo de cromossomas, era difícil obter uma contagem precisa. Além, o método envolve muito tempo e a manipulação de ácidos fortes, que faz inoportuno para o uso em grande escala.

O cytometry de fluxo ultrapassa as desvantagens acima mencionadas desde que determina a quantidade de ADN um pouco a contagem do número de cromossomas. Também, devido à natureza independente do método, não há nenhuma interacção com solventes perigosos.

O cytometry de fluxo é uma técnica exacta, segura

A precisão do cytometry de fluxo é sujeita às seguintes circunstâncias: de baixo nível do coeficiente de variação dos picos do ADN, de uma proporção igual de pilhas em cada pico, e de uma diferença pequena no ADN da amostra e da referência interna.

Por exemplo, se o pico do ADN na referência interna repica em 100, o pico do ADN das amostras deve encontrar-se na escala +/- de 50 do pico da referência. As posições médias devem ser definidas para picos da referência e de amostra. A relação padrão é constante e refere a relação do pico de amostra e do pico da referência.

Cytometry de fluxo para detectar o aneuploidy em amostras da planta

Em amostras da planta, a nervura central de uma folha aberta é cortada usando uma lâmina no prato de petri que consiste no ácido cítrico e no Tween 20. A amostra pode ser filtrada usando uma malha de nylon. O padrão de referência interno, tal como núcleos de glóbulo (RBC) vermelhos e a mancha nuclear são adicionados ao amortecedor.

O índice do ADN é determinado comparando os núcleos da referência interna e os núcleos da amostra, e ao redor 5000-10000 núcleos são analisados para obter uma média. Contudo, em certos casos, todos os cromossomas não podem ter o mesmo número, que pode potencial conduzir às complicações na análise do cytometry de fluxo.

Cytometry de fluxo para detectar o aneuploidy nos cancros

O cytometry de fluxo foi executado igualmente para detectar aberrações no número de cromossoma na carcinoma pequena humana do pulmão da pilha. Neste caso, duas ou três secções do tecido que eram aproximadamente 50 micrômetros largos dewaxed no xileno, foram sujeitadas ao rehydration no álcool etílico, e lavadas então na água destilada.

Os tecidos foram tratados com o citrato e o pepsina para obter suspensões da único-pilha. Estes então foram filtrados na malha de nylon e lavados. Os núcleos separados foram manchados para núcleos usando o iodeto do propidium. Estes núcleos então foram sujeitados ao cytometry de fluxo e analisados usando o software de ModFit.

Analisando os dados

Nos casos onde o coeficiente de variação excede 10%, os histogramas são rejeitados e não usados para a análise final. A amostra é considerada diploid nos casos onde há um único e pico separado na fase G0/G1. Os histogramas que eram tetraploid ou o multiploid são classificados como aneuploid.

Fontes

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Last Updated: Mar 28, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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