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Descubrir aneuploide usando Cytometry de flujo

El aneuploide se define como aberración cromosómica que implica una adición o la supresión de los cromosomas comparados al número “normal” de 46 cromosomas. El cytometry de flujo es una herramienta útil para descubrir anueploidy.  

Síndrome de Down es causado por el aneuploide del cromosoma 21Ambientes médicos de Alila | Shutterstock

¿Por qué cytometry de flujo?

Tradicionalmente, el aneuploide fue diagnosticado contando los cromosomas de la metafase bajo el microscopio. Sin embargo, en muchos casos, y sobre todo debido al número alto o más inferior de cromosomas, era difícil obtener una cuenta exacta. Además, el método implica mucho tiempo y el manejo de ácidos fuertes, que hace inadecuado para el uso en grande.

El cytometry de flujo supera las desventajas ya mencionadas puesto que cuantifica la cantidad de DNA bastante contar el número de cromosomas. También, debido a la naturaleza independiente del método, no hay acción recíproca con los disolventes peligrosos.

El cytometry de flujo es una técnica exacta, segura

La exactitud del cytometry de flujo está conforme a condiciones siguientes: bajo del coeficiente de variación de los picos de la DNA, de una proporción igual de células en cada pico, y de una pequeña diferencia en la DNA de la muestra y de la referencia interna.

Por ejemplo, si el pico de la DNA en la referencia interna enarbola en 100, el pico de la DNA de las muestras debe mentir en el rango de +/- 50 del pico de la referencia. Las posiciones medias se deben definir para los picos de la referencia y de muestra. La índice estándar es constante y refiere a la índice del pico de muestra y del pico de la referencia.

Cytometry de flujo para descubrir aneuploide en muestras de la instalación

En muestras de la instalación, el nervio central de una hoja abierta se corta usando una maquinilla de afeitar en la placa de Petri que consiste en el ácido cítrico y el tween 20. La muestra se puede filtrar usando una malla de nylon. El patrón de referencia interno, tal como núcleos de glóbulo (RBC) rojos y la mancha de óxido nuclear se agregan al almacenador intermedio.

El contenido de la DNA es determinado comparando los núcleos de la referencia interna y los núcleos de la muestra, y alrededor 5000-10000 núcleos se analizan para conseguir un promedio. Sin embargo, en ciertos casos, todos los cromosomas pueden no tener el mismo número, que puede potencialmente llevar a las complicaciones en el análisis del cytometry de flujo.

Cytometry de flujo para descubrir aneuploide en cánceres

El cytometry de flujo también se ha realizado para descubrir aberraciones en el número de cromosoma en pequeño carcinoma humano del pulmón de la célula. En este caso, dos o tres secciones del tejido que eran aproximadamente 50 micrómetros anchos dewaxed en xileno, fueron sujetadas a la rehidratación en etanol, y después lavadas en agua destilada.

Los tejidos fueron tratados con el citrato y la pepsina para obtener suspensiones unicelulares. Éstos después fueron filtrados en la malla de nylon y lavados. Los núcleos disociados fueron manchados para los núcleos usando el yoduro del propidium. Estos núcleos después fueron sujetados al cytometry de flujo y analizados usando el software de ModFit.

Analizar los datos

En caso de que el coeficiente de variación exceda del 10%, los histogramas se desechan y no se utilizan para el análisis final. La muestra se considera diploide en caso de que haya un pico único y separado en la fase G0/G1. Los histogramas que eran tetraploides o el multiploid se clasifican como aneuploides.

Fuentes

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Last Updated: Mar 28, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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