PCR de Digitas e PCR tradicional: Que é a diferença?

PCR de Digitas - Vista geral

Descrito primeiramente nos anos 90, o PCR digital é uma aproximação nova ao PCR que permite a detecção e a quantificação precisas da quantidade de ácidos nucleicos formados durante o PCR.

É diferente do PCR convencional porque conta as moléculas do alvo directamente em um formato digital sem confiar em controles ou em padrões endógenos. Assim, uso digital dos achados do PCR em muitas aplicações que limitam a disponibilidade da amostra e exigindo a sensibilidade alta.

Princípios de PCR de Digitas

A reacção do PCR de Digitas é executada diluindo a mistura da amostra e do ensaio em diversos milhares de compartimentos pequenos. O conceito básico atrás desta diluição é que a concentração da molécula do alvo em cada reacção pode com segurança ser supor porque zero ou um.

No valor-limite, o ciclismo térmico é. Os compartimentos que contido a molécula do alvo mostrarão a fluorescência quando essas que não contêm a fluorescência do fundo da mostra da molécula do alvo somente. As reacções com a molécula do alvo são contadas como 1 ou as reacções PCR-positivas e as reacções sem a molécula do alvo são contadas como 0 ou reacções PCR-negativas.

Após ter contado o grupo completo de reacções, o número de moléculas do alvo no volume inteiro da reacção será igual ao número de reacções positivas contadas. Conseqüentemente a concentração de alvo absoluta pode ser calculada dividindo o número total de moléculas do alvo pelo volume total.

Para a precisão melhor possível, os métodos do dPCR devem ter mecanismos aos erros de controle em volumes medidos e certificar-se lá não é mais de uma molécula do alvo em cada compartimento. As estatísticas de Poisson podem ser usadas para determinar as possibilidades de mais do que uma única molécula do alvo que esta presente em um compartimento. Mais alta a diluição e o número de replicates, mais alta a sensibilidade e precisão da análise do dPCR.

Assim, o PCR digital é uma terceira geração de PCR que emprega uma combinação de diluição da amostra, de PCR do valor-limite, e de estatísticas de Poisson para conseguir uma quantificação absoluta do ácido nucleico. As construções avançadas desta técnica em cima do PCR tradicional e são ideais para as aplicações que exigem a detecção de quantidades minúsculas de amostra do ácido nucleico tais como a análise da variação do número de cópia, a análise rara da expressão genética, a única análise da pilha, e a detecção rara da seqüência.

Vantagens do PCR de Digitas

As vantagens chaves do PCR digital estão listadas abaixo:

  • Nenhuma dependência em padrões ou em referências
  • Detecção linear de mudanças da acta-dobra
  • Capacidade para analisar eventos raros e misturas complexas
  • Altamente inibidor-tolerante
  • Allows aumentou a precisão aumentando compartimentos da diluição e do alvo

Diferenças entre o PCR tradicional e o PCR de Digitas

As diferenças chaves entre o PCR tradicional e o PCR digital são tabuladas abaixo:

PCR tradicional PCR de Digitas

O PCR tradicional calcula a quantidade de produto amplificado do PCR na extremidade de diversos ciclos do PCR.

O PCR de Digitas mede o número de moléculas do alvo directamente contando a fluorescência positiva nos compartimentos.

O PCR tradicional é semiquantitativo o melhor possível. A concentração de ácidos nucleicos pode ser determinada a uma extensão comparando a intensidade de faixa amplificada em um gel da electroforese a um padrão conhecido.

O PCR de Digitas permite a quantificação absoluta da molécula do alvo usando uma mistura original da diluição da amostra e do algoritmo estatístico de Poisson.

O uso do PCR tradicional é limitado à amplificação de ácidos nucleicos para arranjar em seqüência, clonar, e genotyping

O PCR de Digitas é altamente sensível e exacto e pode ser usado eficazmente na medida absoluta de ácidos nucleicos, da detecção rara do gene, e da quantificação absoluta da expressão genética

O PCR tradicional tem a baixa sensibilidade e a precisão deficiente

No PCR digital, desejado ao nível da precisão pode ser conseguido aumentando o número de replicates

O PCR tradicional é um processo não-automatizado

O PCR de Digitas pode facilmente ser automatizado para uma precisão mais alta

Somente a discriminação tamanho-baseada é possível no PCR tradicional

O PCR de Digitas pode ser usado para a análise exacta de misturas complexas

Nenhuma expressão numérica dos resultados e do processamento cargo-PCR é exigida no PCR tradicional

O PCR de Digitas fornece resultados de fácil utilização no formato digital

Referências

[Leitura adicional: Reacção em cadeia da polimerase]

Last Updated: Feb 26, 2019

Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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