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Microscopie d'E-FRET pour la représentation sous tension de cellules

La microscopie d'E-FRET est récent devenue une méthode basée sur intensité très populaire de transfert d'énergie de résonance (FRET) de fluorescence pour la quantification de cellules. Cette technique réduit photobleaching observé au cours du processus de la FRETTE.

Image de fluorescenceKarl Dupont | Shutterstock

Pourquoi E-FRET ?

Pendant la FRETTE, l'excitation de la molécule de distributeur est transférée à l'accepteur, s'ils sont dans l'apposition proche entre eux. Après que le transfert, la fluorescence du donneur soit trempé, alors que la fluorescence de l'accepteur est induite.

Le rapport de la fluorescence d'accepteur et de donneur est alors prévu avant et après la FRETTE. Cette méthode aide à concevoir et mesurer les interactions à un niveau moléculaire. Cependant, une limitation importante de la FRETTE photobleaching, qui est un procédé où le fluorophore est de manière permanente modifié tels qu'il peut plus ne briller par fluorescence.

En outre, les index de FRETTE dépendent des paramètres optiques du système sur lequel elle est exécutée. Ceci la rend difficile et encombrante pour mesurer et comparer des caractéristiques entre les laboratoires dans différentes régions et/ou les pays.

Système de représentation de FRETTE

Dans ce système, le matériel est conçu tels que l'émission de donneur et d'accepteur peut être simultanément rassemblée pendant le procédé d'excitation du donneur. Ceci est fait à l'aide de deux appareils-photo de CoolSnapHQ fixés à un microscope de Zeiss avec un beamsplitter et des filtres stationnaires d'émission.

La commutation des longueurs d'onde entre le donneur et l'émission d'accepteur est réalisée utilisant un illuminateur du galvo DG4 qui est personnalisé avec une lampe xénon. Le système est managé et les images sont alignées avec l'utilisation du logiciel de Slidebook. Les filtres optiques suivants sont utilisés : 430/25 de nanomètres, 470/30 de nanomètres (pour la PCP) et 510/20 des nanomètres, 550/50 de nanomètres (pour le YFP).

Formules d'E-FRET

Pour comprendre l'interférence entre l'accepteur et les molécules de donneur, les cellules réservées à l'accepteur et réservées au donneur sont imagées en utilisant une combinaison des filtres suivants : émission de distributeur d'excitation-donneur (i)DD, émission de distributeur d'excitation-accepteur (i)DA, et émission d'excitation-accepteur d'accepteur (i)AA.

Le rendement de FRETTE (e) est une mesure critique qui est employée pour mesurer la FRETTE. Le rendement est défini comme proportion des conditions enthousiastes du donneur qui sont transférées à l'accepteur. Le rendement apparent de la FRETTE peut être prévu par la formule suivante :

E APP = (post I DD- DDI) post I DD

Là où post I DD est le goujon de paramètre photobleaching de distributeur.

Un paramètre G appelé est aussi bien prévu, qui est un paramètre continuel pour un système spécifique de représentation et fluorophore. Ce paramètre est indépendant du rendement de FRETTE et peut être étalonné quand des fluorophores et les durées d'exposition assimilés sont mis à jour.

Rectification de photobleaching

Photobleaching peut mener aux erreurs et à la perte de fluorescence pendant la représentation de temps-déchéance et de tridimensionnel. Pour introduire photobleaching représentation-induit, un paramètre E appelécorr est introduit, qui est le rendement de FRETTE en conditions quand il n'y a aucun photobleaching. Ecorr peut être défini en tant que ([DE X/Y]/[X total]) /E, où DE X/Y est la fluorescence des composés DE X/Y.

E-FRET robotisé

Récent, on a conçu un E-FRET robotisé qui vient avec une surface adjacente conviviale. Le procédé de l'automatisation ramène la période de la FRETTE d'E de 12 secondes à 3 secondes. D'abord, les cellules sont localisées, et alors « captez » le bouton peut être cliqué sur pour exécuter automatiquement la procédure d'E-FRET. La FRETTE robotisée peut agir en tant qu'outil pratique pour exécuter la représentation quantitative de FRETTE des cellules sous tension.

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Last Updated: Jun 20, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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