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Microscopia di E-FRET per rappresentazione in tensione delle cellule

La microscopia di E-FRET recentemente si è trasformata in ad un in un metodo basato a intensità molto popolare di trasferimento di energia di risonanza (FRET) della fluorescenza per quantificazione delle cellule. Questa tecnica diminuisce photobleaching osservato nella fase del CERCHIO.

Immagine di fluorescenzaCarl Du Pont | Shutterstock

Perché E-FRET?

Durante il CERCHIO, l'eccitazione della molecola erogatrice è trasferita al ricettore, se sono l'un l'altro nell'apposizione vicina. Dopo che il trasferimento, la fluorescenza del donatore è estiguuto, mentre la fluorescenza del ricettore è indotta.

Il rapporto della fluorescenza del donatore e del ricettore poi è calcolato prima e dopo il CERCHIO. Questo metodo contribuisce a prevedere e quantificare le interazioni ad un livello molecolare. Tuttavia, una limitazione importante del CERCHIO photobleaching, che è un trattamento dove il fluorophore permanentemente sarà alterato tali che può più non essere flourescente.

Inoltre, gli indici analitici del CERCHIO dipendono dai parametri ottici del sistema su cui è eseguita. Ciò la rende difficile ed ingombrante per quantificare e confrontare i dati fra i laboratori nelle regioni differenti e/o i paesi.

Sistema di rappresentazione del CERCHIO

In questo sistema, la strumentazione è progettata tali che l'emissione del ricettore e del donatore può essere raccolta simultaneamente durante il trattamento di eccitazione del donatore. Ciò è fatta mediante usando due macchine fotografiche di CoolSnapHQ fissate ad un microscopio di Zeiss con un beamsplitter ed i filtri fissi dall'emissione.

La commutazione delle lunghezze d'onda fra il donatore e l'emissione del ricettore è raggiunta facendo uso di una lampadina di galvo DG4 che è personalizzata con una lampada allo xeno. Il sistema è gestito e le immagini sono state allineate rispetto all'uso del software di Slidebook. I seguenti filtri ottici sono utilizzati: 430/25 di nanometri, 470/30 di nanometri (per il CFP) e 510/20 di nanometri, 550/50 di nanometri (per YFP).

Formule di E-FRET

Per capire l'interferenza fra il ricettore e le molecole del donatore, le celle solo ricettore e solo donatore sono imaged impiegando una combinazione di seguenti filtri: emissione erogatrice del eccitazione-donatore (i)DD, emissione erogatrice del eccitazione-ricettore (i)DA ed emissione del eccitazione-ricettore del ricettore (i)AA.

Risparmio di temi del CERCHIO (E) è una misura critica che è usata per misurare il CERCHIO. Il risparmio di temi è definito come la percentuale di stati eccitati del donatore che sono trasferiti al ricettore. Il risparmio di temi evidente del CERCHIO può essere calcolato dalla seguente formula:

E app = (post I DD- DDI) post I DD

Dove post la I DD è il paletto di parametro photobleaching erogatore.

Un parametro chiamato G è calcolato pure, che è un parametro costante per un sistema specifico della rappresentazione e fluorophore. Questo parametro è indipendente dal risparmio di temi del CERCHIO e può essere calibrato quando i simili fluorophores e tempi di esposizione sono mantenuti.

Correzione photobleaching

Photobleaching può piombo agli errori ed alla perdita di fluorescenza durante la rappresentazione al rallentatore e tridimensionale. Per introdurre dal il photobleaching indotto da rappresentazione, un parametro chiamato Ecorr è introdotto, che è il risparmio di temi del CERCHIO nelle circostanze quando non c'è photobleaching. La Ecorr può essere definita come ([DI X-Y]/[X total]) /E, dove DI X-Y è la fluorescenza dei complessi DI X-Y.

E-FRET automatizzato

Recentemente, un E-FRET automatizzato è stato progettato che viene con un'interfaccia facile da usare. Il trattamento di automazione riduce il periodo del CERCHIO di E a partire da 12 secondi a 3 secondi. In primo luogo, le celle sono individuate e poi “catturi„ il bottone può essere cliccatoe per eseguire automaticamente la procedura di E-FRET. Il CERCHIO automatizzato può fungere da strumento conveniente per eseguire la rappresentazione quantitativa del CERCHIO delle celle in tensione.

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Last Updated: Jun 20, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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