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Microscopia de E-FRET para a imagem lactente viva da pilha

A microscopia de E-FRET transformou-se recentemente um método intensidade-baseado muito popular de transferência de energia da ressonância (FRET) da fluorescência para a quantificação da pilha. Esta técnica reduz photobleaching observado durante o processo de FRICÇÃO.

Imagem da fluorescênciaCarl Du Pont | Shutterstock

Por que E-FRET?

Durante a FRICÇÃO, a excitação da molécula fornecedora está transferida ao autómato, desde que estão na justaposição próxima entre si. Depois que transferência, a fluorescência do doador está extinguida, quando a fluorescência do autómato estiver induzida.

A relação da fluorescência do autómato e do doador é calculada então antes e depois da FRICÇÃO. Este método ajuda a visualizar e determinar as interacções a nível molecular. Contudo, uma limitação principal da FRICÇÃO photobleaching, que é um processo onde o fluoróforo seja alterado permanentemente tais que pode já não brilhar.

Também, os deslocamentos predeterminados da FRICÇÃO dependem dos parâmetros ópticos do sistema em que é executada. Isto torna-a difícil e incómoda para determinar e comparar dados entre laboratórios em regiões diferentes e/ou países.

Sistema da imagem lactente da FRICÇÃO

Neste sistema, o equipamento é projectado tais que a emissão do doador e do autómato pode simultaneamente ser recolhida durante o processo da excitação do doador. Isto é feito usando duas câmeras de CoolSnapHQ anexadas a um microscópio de Zeiss com um beamsplitter e uns filtros estacionários da emissão.

O interruptor dos comprimentos de onda entre o doador e a emissão do autómato é conseguido usando um iluminador do galvo DG4 que seja personalizado com uma lâmpada de xénon. O sistema é controlado e as imagens são alinhadas com o uso do software de Slidebook. Os seguintes filtros ópticos são usados: 430/25 dos nanômetros, 470/30 dos nanômetros (para o CFP) e 510/20 dos nanômetros, 550/50 dos nanômetros (para YFP).

Fórmulas de E-FRET

Para compreender a interferência entre o autómato e as moléculas do doador, o autómato-somente e as pilhas do doador-somente são imaged empregando uma combinação de seguintes filtros: emissão fornecedora do excitação-doador (i)DD, emissão fornecedora do excitação-autómato (i)DA, e emissão do excitação-autómato do autómato (i)AA.

A eficiência da FRICÇÃO (e) é uma medida crítica que seja usada para medir a FRICÇÃO. A eficiência é definida como a proporção dos estados entusiasmado do doador que são transferidos ao autómato. A eficiência aparente da FRICÇÃO pode ser calculada pela seguinte fórmula:

E app = (post I DD- DDI) post mim DD

Onde post I DD é o cargo do parâmetro photobleaching fornecedor.

Um parâmetro chamado G é calculado também, que é um parâmetro constante para um sistema específico da imagem lactente e fluoróforo. Este parâmetro é independente da eficiência da FRICÇÃO e pode ser calibrado quando os fluorophores e os tempos de exposição similares são mantidos.

Corrigindo photobleaching

Photobleaching pode conduzir aos erros e à perda de fluorescência durante o tempo-lapso e a imagem lactente tridimensional. Para introduzir imagem-induziu photobleaching, um parâmetro chamado Ecorr é introduzida, que é a eficiência da FRICÇÃO nas circunstâncias quando não há nenhum photobleaching. Ecorr pode ser definido como ([XY]/[X total]) /E, onde XY é a fluorescência dos complexos XY.

E-FRET automatizado

Recentemente, um E-FRET automatizado foi projectado que viesse com uma relação de fácil utilização. O processo de automatização reduz a época da FRICÇÃO de E de 12 segundos a 3 segundos. Primeiramente, as pilhas são encontradas, e então “capture” o botão pode ser clicado para executar automaticamente o procedimento de E-FRET. A FRICÇÃO automatizada pode actuar como uma ferramenta conveniente para executar a imagem lactente quantitativa da FRICÇÃO de pilhas vivas.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Jun 20, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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