A microscopia de E-FRET transformou-se recentemente um método intensidade-baseado muito popular de transferência de energia da ressonância (FRET) da fluorescência para a quantificação da pilha. Esta técnica reduz photobleaching observado durante o processo de FRICÇÃO.
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Por que E-FRET?
Durante a FRICÇÃO, a excitação da molécula fornecedora está transferida ao autómato, desde que estão na justaposição próxima entre si. Depois que transferência, a fluorescência do doador está extinguida, quando a fluorescência do autómato estiver induzida.
A relação da fluorescência do autómato e do doador é calculada então antes e depois da FRICÇÃO. Este método ajuda a visualizar e determinar as interacções a nível molecular. Contudo, uma limitação principal da FRICÇÃO photobleaching, que é um processo onde o fluoróforo seja alterado permanentemente tais que pode já não brilhar.
Também, os deslocamentos predeterminados da FRICÇÃO dependem dos parâmetros ópticos do sistema em que é executada. Isto torna-a difícil e incómoda para determinar e comparar dados entre laboratórios em regiões diferentes e/ou países.
Sistema da imagem lactente da FRICÇÃO
Neste sistema, o equipamento é projectado tais que a emissão do doador e do autómato pode simultaneamente ser recolhida durante o processo da excitação do doador. Isto é feito usando duas câmeras de CoolSnapHQ anexadas a um microscópio de Zeiss com um beamsplitter e uns filtros estacionários da emissão.
O interruptor dos comprimentos de onda entre o doador e a emissão do autómato é conseguido usando um iluminador do galvo DG4 que seja personalizado com uma lâmpada de xénon. O sistema é controlado e as imagens são alinhadas com o uso do software de Slidebook. Os seguintes filtros ópticos são usados: 430/25 dos nanômetros, 470/30 dos nanômetros (para o CFP) e 510/20 dos nanômetros, 550/50 dos nanômetros (para YFP).
Fórmulas de E-FRET
Para compreender a interferência entre o autómato e as moléculas do doador, o autómato-somente e as pilhas do doador-somente são imaged empregando uma combinação de seguintes filtros: emissão fornecedora do excitação-doador (i)DD, emissão fornecedora do excitação-autómato (i)DA, e emissão do excitação-autómato do autómato (i)AA.
A eficiência da FRICÇÃO (e) é uma medida crítica que seja usada para medir a FRICÇÃO. A eficiência é definida como a proporção dos estados entusiasmado do doador que são transferidos ao autómato. A eficiência aparente da FRICÇÃO pode ser calculada pela seguinte fórmula:
E app = (post I DD- DDI) post mim DD
Onde post I DD é o cargo do parâmetro photobleaching fornecedor.
Um parâmetro chamado G é calculado também, que é um parâmetro constante para um sistema específico da imagem lactente e fluoróforo. Este parâmetro é independente da eficiência da FRICÇÃO e pode ser calibrado quando os fluorophores e os tempos de exposição similares são mantidos.
Corrigindo photobleaching
Photobleaching pode conduzir aos erros e à perda de fluorescência durante o tempo-lapso e a imagem lactente tridimensional. Para introduzir imagem-induziu photobleaching, um parâmetro chamado Ecorr é introduzida, que é a eficiência da FRICÇÃO nas circunstâncias quando não há nenhum photobleaching. Ecorr pode ser definido como ([XY]/[X total]) /E, onde XY é a fluorescência dos complexos XY.
E-FRET automatizado
Recentemente, um E-FRET automatizado foi projectado que viesse com uma relação de fácil utilização. O processo de automatização reduz a época da FRICÇÃO de E de 12 segundos a 3 segundos. Primeiramente, as pilhas são encontradas, e então “capture” o botão pode ser clicado para executar automaticamente o procedimento de E-FRET. A FRICÇÃO automatizada pode actuar como uma ferramenta conveniente para executar a imagem lactente quantitativa da FRICÇÃO de pilhas vivas.
Fontes
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