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Microscopia de E-FRET para la proyección de imagen viva de la célula

La microscopia de E-FRET se convirtió en recientemente un método intensidad-basado muy popular de la transferencia de energía de resonancia (FRET) de la fluorescencia para la cuantificación de la célula. Esta técnica reduce photobleaching observado durante el proceso de TRASTE.

Imagen de la fluorescenciaCarl Du Pont | Shutterstock

¿Por qué E-FRET?

Durante TRASTE, la excitación de la molécula dispensadora de aceite se transfiere al aceptor, con tal que estén en la aposición cercana el uno al otro. Después de que se apague la transferencia, la fluorescencia del donante, mientras que la fluorescencia del aceptor se induce.

La índice de la fluorescencia del aceptor y del donante entonces se calcula antes y después de TRASTE. Este método ayuda a visualizar y a cuantificar las acciones recíprocas en un nivel molecular. Sin embargo, una limitación importante del TRASTE photobleaching, que es un proceso donde el fluoróforo permanente se altera tales que puede ser fluorescente no más.

También, los índices del TRASTE dependen de los parámetros ópticos del sistema en el cual se realiza. Esto la hace difícil e incómoda para cuantificar y para comparar datos entre los laboratorios en diversas regiones y/o los países.

Sistema de la proyección de imagen del TRASTE

En este sistema, el equipo se diseña tales que la emisión del donante y del aceptor se puede cerco simultáneamente durante el proceso de la excitación del donante. Esto se hace usando dos cámaras de CoolSnapHQ sujetadas a un microscopio de Zeiss con un beamsplitter y filtros estacionarios de la emisión.

La transferencia de longitudes de onda entre el donante y la emisión del aceptor se logra usando un iluminador del galvo DG4 que se modifique para requisitos particulares con una lámpara de xenón. Se maneja el sistema y las imágenes se alinean con el uso del software de Slidebook. Se utilizan los filtros ópticos siguientes: 430/25 de los nanómetros, 470/30 de los nanómetros (para el CFP) y 510/20 de los nanómetros, 550/50 de los nanómetros (para YFP).

Fórmulas de E-FRET

Para entender la diafonía entre el aceptor y las moléculas del donante, el aceptor-solamente y las células del donante-solamente son reflejados empleando una combinación de filtros siguientes: emisión dispensadora de aceite del excitación-donante (i)DD, emisión dispensadora de aceite del excitación-aceptor (i)DA, y emisión del excitación-aceptor del aceptor (i)AA.

La eficiencia del TRASTE (e) es una medida crítica que se utiliza para medir el TRASTE. La eficiencia se define como la proporción de los estados emocionados del donante que se transfieren al aceptor. La eficiencia evidente del TRASTE se puede calcular por la fórmula siguiente:

E app = (post I DD-) DD/I post de I DD

Donde post está DD el poste I del parámetro el photobleaching dispensador de aceite.

Un parámetro llamado G se calcula también, que es un parámetro constante para un sistema específico de la proyección de imagen y fluoróforo. Este parámetro es independiente de la eficiencia del TRASTE y puede ser calibrado cuando se mantienen los fluorophores y los tiempos de exposición similares.

Corrección de photobleaching

Photobleaching puede llevar a los desvíos y a la baja de la fluorescencia durante proyección de imagen de time lapse y tridimensional. Para se introduce introducir proyección de imagen-indujo photobleaching, un parámetro llamadocorr E, que es la eficiencia del TRASTE en condiciones cuando no hay el photobleaching. Ecorr se puede definir como ([XY]/[X total]) /E, cuando sea XY es la fluorescencia de los complejos XY.

E-FRET automatizado

Recientemente, se ha diseñado un E-FRET automatizado que viene con un interfaz convivial. El proceso de la automatización reduce la época del TRASTE de E a partir de 12 segundos a 3 segundos. Primero, se localizan las células, y entonces “capture” el botón puede ser enganchado para realizar automáticamente el procedimiento de E-FRET. El TRASTE automatizado puede actuar como herramienta conveniente para realizar la proyección de imagen cuantitativa del TRASTE de células vivas.

Fuentes

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Last Updated: Jun 20, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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