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ELISA : Comment analyser des résultats expérimentaux

L'ELISA, ou la méthode ELISA, est un outil utilisé pour trouver et mesurer des substances, telles que des peptides, des protéines, des anticorps, et des hormones. Il comporte l'immobilisation d'un antigène ou d'un anticorps sur une surface, suivie de l'ajout d'un échantillon à s'analyser. Le dépistage dépend d'une réaction spécifique d'antigène-anticorps.

Plaque d

Jarun Ontakrai | Shutterstock

Ce qui à faire avant de faire fonctionner un ELISA

Un essai d'ELISA devrait toujours être réalisé dans les répliques (des doubles ou des triples exemplaires) afin de réaliser assez de numéro des échantillons pour prévoir l'écart-type et le coefficient de variation. Le coefficient de l'erreur devrait être mis à jour moins de 20%. Si l'erreur prévue est élevée, alors surgir d'erreurs dû à introduire à la pipette, la contamination des plaques et des réactifs, l'évaporation, et/ou la température doivent être évalués.

Courbure normale

Une courbure normale est employée pour mesurer la concentration de l'échantillon. D'abord, les valeurs d'absorbance des concentrations normales (pg/ml) sont tracées. Une courbure négative est également faite qui ne contient aucune caractéristique d'échantillon normal et est employée pour trouver et mesurer le bruit de fond. Pour une mesure précise, cette valeur de mouvement propre doit être soustraite de la courbure normale.

Les valeurs d'absorbance de la concentration connue peuvent être tracées comme contrôle positif. La concentration de la protéine cible est dérivée en prévoyant d'abord la moyenne absorbance et alors utilisant la courbure normale pour estimer la concentration.

Des facteurs de dilution devraient également être tenus compte. Par exemple, si l'échantillon a été dilué quatre fois autant, puis l'absorbance devrait être multiplié par quatre avant d'employer la courbure normale pour dériver la concentration.

Coefficient de variation

La définition du coefficient de variation est le rapport de l'écart-type et du moyen - c.-à-d. écart-type (σ) /mean (µ). Les grandes valeurs du coefficient de variation indique des inexactitudes dues à introduire à la pipette ou à se mélanger des réactifs entre les puits, la contamination bactérienne ou fongique, se dessécher des puits, ou les variations de la température.

Guérison de pointe

La valeur obtenue après avoir exécuté le test d'ELISA dépend de la façon dont une protéine visée agit l'un sur l'autre avec des anticorps, et cette interaction est comparée à une courbure normale de protéine. Plusieurs facteurs - comprenant le tampon, la modification et les anticorps heterophilic - peuvent affecter le grippement de l'échantillon, ainsi ceci doivent être tenus compte en déterminant l'exactitude d'un ELISA.

Une analyse de pointe peut être exécutée pour déterminer l'exactitude des résultats d'ELISA. Dans cette analyse, une quantité connue de protéine recombinée est ajoutée ou clouée dedans à l'échantillon. Puis, utilisant la courbure normale la quantité de matériau est mesurée. Les grands écarts en valeurs mesurées peuvent indiquer des erreurs dues aux éléments inconnus dans l'analyse.

Analyse de linéarité

L'analyse de linéarité est également employée pour déterminer l'exactitude de l'ELISA. Dans ce cas, l'échantillon cloué par `' est séquentiel dilué au 1:2, au 1:4 et à 1 : 8. Si la concentration de l'échantillon modifié est trouvée, et si les résultats ne manifestent pas un changement linéaire des mesures, il peut indiquer des erreurs dans l'exactitude de l'ELISA.

Dans certains cas, on ne peut être observé à certaines concentrations et plus observer des erreurs aux concentrations inférieures. Dans de tels cas, l'échantillon peut devoir être dilué avant que les mesures de concentration soient exécutées.

Déboguer

Le bruit de fond peut être provoqué par un certain nombre de facteurs, comprenant :

  • Lavage insuffisant des puits
  • Tampons contaminés de lavage
  • Excessif réactif de dépistage
  • Activité hétérospécifique de l'anticorps
  • Précipitation du tampon et/ou de l'analyte

Parfois, la courbure normale faible peut être produite. Ceci peut être dû aux erreurs dans la solution étalon, dégradation de norme, la norme est incorrect reconstituée, ou si la courbure n'adapte pas l'écaille. Vu que ce dernier, traçant peuvent être faits utilisant différentes écailles, telles que le log-log ou la courbure logistique de 5 paramètres.

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Last Updated: Jan 2, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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