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ELISA: Como analisar resultados experimentais

ELISA, ou o ensaio Enzima-Ligado da imunoabsorção, são uma ferramenta usada para detectar e determinar substâncias, tais como peptides, proteínas, anticorpos, e hormonas. Envolve a imobilização de um antígeno ou de um anticorpo em uma superfície, seguida pela adição de uma amostra a ser analisada. A detecção é dependente de uma reacção específica do antígeno-anticorpo.

Placa de ELISA com mudança alaranjada e amarela da cor - represente tomado por Jarun Ontakrai

Jarun Ontakrai | Shutterstock

Que a fazer antes de executar um ELISA

Um teste de ELISA deve sempre ser executado nos replicates (duplicatas ou triplicates) para conseguir bastante número de amostras para calcular o desvio padrão e o coeficiente de variação. O coeficiente do erro deve ser mantido menos de 20%. Se o erro calculado é alto, a seguir elevarar dos erros devido a introduzir com pipeta, a contaminação de placas e de reagentes, a evaporação, e/ou a temperatura têm que ser avaliadas.

Curva padrão

Uma curva padrão é usada para medir a concentração da amostra. Primeiramente, os valores da absorvência das concentrações padrão (pg/ml) são traçados. Uma curva negativa igualmente é feita que não contenha nenhuns dados da amostra padrão e usada para detectar e medir o ruído de fundo. Para uma medida exacta, este valor de fundo deve ser subtraído da curva padrão.

Os valores da absorvência da concentração conhecida podem ser traçados como um controle positivo. A concentração da proteína do alvo é derivada primeiramente calculando a absorvência média e então usando a curva padrão para calcular a concentração.

Os factores da diluição devem igualmente ser levados em consideração. Por exemplo, se a amostra foi diluída quatro vezes mais, a seguir a absorvência deve ser multiplicado por quatro antes de usar a curva padrão para derivar a concentração.

Coeficiente de variação

A definição do coeficiente de variação é a relação do desvio padrão e do meio - isto é desvio padrão (σ) /mean (µ). Os grandes valores do coeficiente de variação indicam as irregularidades devido a introduzir com pipeta ou à misturar dos reagentes entre poços, contaminação bacteriana ou fungosa, secagem dos poços, ou variações da temperatura.

Recuperação do ponto

O valor obtido após ter executado o teste de ELISA depende de como uma proteína visada interage com os anticorpos, e esta interacção é comparada a uma curva padrão da proteína. Diversos factores - incluindo o amortecedor, a matriz e anticorpos heterophilic - podem afectar o emperramento da amostra, assim que este devem ser levados em consideração ao determinar a precisão de um ELISA.

Um ensaio do ponto pode ser executado para determinar a precisão de resultados de ELISA. Neste ensaio, uma quantidade conhecida de proteína de recombinação é adicionada ou cravada dentro à amostra. Então, usando a curva padrão a quantidade de material é medida. Os grandes desvios nos valores medidos podem indicar os erros devido aos elementos desconhecidos no ensaio.

Ensaio das linearidades

As linearidades analisam são usadas igualmente para determinar a precisão de ELISA. Neste caso, a amostra cravada `' é diluída em série ao 1:2, ao 1:4 e a 1: 8. Se a concentração da amostra alterada está detectada, e se os resultados não indicam uma mudança linear nas medidas, pode indicar erros na precisão de ELISA.

Em alguns casos, os erros podem ser observados em determinadas concentrações e já não ser observados em umas mais baixas concentrações. Em tais exemplos, a amostra pode ter que ser diluído antes que as medidas da concentração estejam executadas.

Pesquisa de defeitos

O ruído de fundo pode ser causado por um número de factores, incluindo:

  • Insuficiente lavagem dos poços
  • Amortecedores contaminados da lavagem
  • Demasiado reagente da detecção
  • Reactividade cruzada do anticorpo
  • Precipitação do amortecedor e/ou do analyte

Às vezes, a curva padrão deficiente pode ser gerada. Isto pode ser devido aos erros na solução padrão, degradação do padrão, o padrão está reconstituído impropriamente, ou se a curva não cabe a escala. Considerando que os últimos, traçando podem ser feitos usando escalas diferentes, tais como dos 5 parâmetros a curva logística do registro-registro ou.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Jan 2, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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