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Électroperméabilisation et la production des souris Knockout

Les souris Knockout sont des animaux pour lesquels ont été génétiquement modifiés de sorte qu'un ou plusieurs gènes ne soient pas exprimés, ou « ont été frappés à l'extérieur. » Des études sont alors effectuées sur les souris pour déterminer ce que les effets d'une perte du gène ont sur l'animal, ou les effets des médicaments et d'autres traitements.

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La technologie de retouche de gène a été montrée pour avoir des avantages par rapport à des techniques plus anciennes de génie génétique pour produire les souris knockout. Les technologies de retouche de gène qui ont été avec succès employées à cet effet comprennent la nucléase de doigt à zinc (ZFN), la nucléase effectrice comme un activateur de transcription (TALEN), et la nucléase palindromique courte régulièrement interspaced groupée (CRISPR) de répétitions.

Le système CRISPR-cas9 en particulier est devenu une approche préférée pour le bureau d'études de génome de souris. Le moyen classique d'introduire les composantes de CRISPR dans des embryons de souris pour éditer ou assommer un gène est par microinjection. Cependant, le microinjection exige un haut niveau de technique et est de main-d'oeuvre parce que des embryons doivent être injectés un par un.

Mice "Tales"...the Knockout Mouse Production and Phenotyping Project

Une technique neuve

Une méthode d'électroperméabilisation a été développée par des chercheurs au Japon comme alternative pour fournir des éléments de retouche de gène en technique appelée d'embryon « pour le système Knockout animal par électroperméabilisation (la PRISE). » Cette méthode introduit efficacement les réactifs dans des zygotes de souris sans le besoin d'offre spéciale ne traitant des qualifications et aucun dégât au pellucida de zona (une couche de glycoprotéine entourant la membrane de plasma) de l'embryon, ce qui est souvent le cas avec l'électroperméabilisation conventionnelle.

Les scientifiques ont introduit ZFN, TALEN, et CRISPR ARNm dans des embryons de rat utilisant le NEPA superbe 21 d'Electroporator utilisant un système en trois étapes de pouls. Dans la première étape, le pouls produit des micro-trous dans la membrane de pellucida et de plasma de zona des embryons. Dans la prochaine opération, un ensemble différent de pouls pilotent l'ARNm dans le cytoplasme par les micropores. Dans la troisième opération, la polarité est changée pour compléter le transfert de l'ARNm dans les embryons. Ils microinjected également l'ARNm pour la comparaison.

Résultats positifs

Après électroperméabilisation, des embryons à l'étape de 2 cellules ont été transférés dans les rats femelles de remplacement. Dix pour cent d'embryons microinjected avec ZFN ARNm développé en progéniture, et 33 pour cent de ceux ont eu la retouche correcte du gène cible. En revanche, 31, 24, et 6 pour cent d'embryons electroporated avec Mme 0,5 Mme, 1,5, et 2,5 pouls de Mme développés en progéniture, avec la retouche correcte du gène cible dans 37, 73, et 75 pour cent de progéniture.

Des résultats positifs assimilés ont été réalisés avec des systèmes de la retouche TALEN et CRISPR-cas9.

Afin de confirmer la boîte de vitesses de lignée germinale, une certaine progéniture knockout de rat dérivée des embryons electroporated avec ZFN ARNm avec une durée d'impulsion de 1,5 Mme ont été conjuguées aux rats sauvages de type, et le prochain rétablissement de la progéniture s'est analysé. Ils ont constaté que leur méthode a avec succès produit la boîte de vitesses de lignée germinale du coup de grâce de gène.

Les chercheurs ont conclu que leur méthode était comparée simple et efficace aux méthodes d'électroperméabilisation de convention qui affaiblissent ou retirent le pellucida de zona. L'utilisation de l'électroperméabilisation permet également le rétablissement des animaux knockout dans les tensions et la substance qui n'ont pas déterminé les lignées cellulaires embryonnaires de cheminée, qui est nécessaire dans des méthodes conventionnelles.

Références

  1. Électroperméabilisation : Une alternative au microinjection pour produire les rongeurs génétiquement modifiés, https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/electroporation-an-alternative-to-microinjection-for-creating-genetically-modified-rodents
  2. Coup de grâce simple par l'électroperméabilisation des endonucléases conçues dans les embryons intacts de rat, https://www.nature.com/articles/srep06382
  3. La distribution efficace d'ADN et de morpholinos dans des embryons de preimplantation de souris par électroperméabilisation, https://www.wsj.com/articles/the-real-reason-ford-is-phasing-out-its-sedans-1525369304

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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