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Elettroporazione e la produzione dei mouse Knockout

I mouse Knockout sono animali cui geneticamente sono stati modificati per in moda da non esprimere uno o più geni, o “sono stati tramortiti.„ Gli studi poi sono effettuati sui mouse per determinare che cosa gli effetti di una perdita del gene hanno sull'animale, o gli effetti delle droghe e di altre terapie.

Credito di immagine: unoL/Shutterstock
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Il gene che modifica la tecnologia è stato indicato per presentare i vantaggi sopra le più vecchie tecniche dell'ingegneria genetica per la produzione dei mouse knockout. Il gene che modifica le tecnologie che sono state usate con successo a questo fine include la nucleasi del dito di zinco (ZFN), la nucleasi del tipo di attivatore dell'effettore della trascrizione (TALEN) e la breve nucleasi palindromica regolarmente interspaced ragruppata (CRISPR) di ripetizioni.

Il sistema CRISPR-cas9 in particolare si è trasformato in in un approccio preferito per assistenza tecnica del genoma del mouse. Il modo usuale di introdurre le componenti di CRISPR negli embrioni del mouse per modificare o tramortire un gene è dal microinjection. Tuttavia, il microinjection richiede un ad alto livello di abilità ed è ad alto contenuto di manodopera perché gli embrioni devono essere iniettati uno alla volta.

Mice "Tales"...the Knockout Mouse Production and Phenotyping Project

Una nuova tecnica

Un metodo di elettroporazione è stato messo a punto dai ricercatori nel Giappone come alternativa per la consegna del gene che modificano gli elementi in un embrione chiamato “tecnica per il sistema Knockout animale dall'elettroporazione (PRESA).„ Questo metodo presenta efficientemente i reagenti negli zygotes del mouse senza esigenza dello speciale che non tratta le abilità e danneggiamento della zona pellucida (un livello della glicoproteina che circonda la membrana di plasma) dell'embrione, come spesso avviene con l'elettroporazione convenzionale.

Gli scienziati hanno presentato ZFN, TALEN e CRISPR mRNA negli embrioni del ratto facendo uso del NEPA eccellente 21 di Electroporator facendo uso di un sistema in tre tappe di impulso. Al primo punto, l'impulso crea i micro-fori nella zona pellucida e la membrana di plasma degli embrioni. Al punto seguente, un insieme differente degli impulsi guida il mRNA nel citoplasma attraverso i micropori. Al terzo punto, la polarità è cambiata per completare il trasferimento del mRNA negli embrioni. Egualmente microinjected il mRNA per il confronto.

Risultati positivi

Dopo l'elettroporazione, gli embrioni nella fase di 2 cellule sono stati trasferiti nei ratti femminili sostitutivi. Dieci per cento degli embrioni microinjected con ZFN mRNA sviluppato nella prole e 33 per cento di quelli hanno avuti modificare corretto del gene dell'obiettivo. Al contrario, 31, 24 e 6 per cento degli embrioni electroporated con spettrografia di massa 0,5 spettrografia di massa, 1,5 e 2,5 impulsi di spettrografia di massa sviluppati nella prole, con modificare corretto del gene dell'obiettivo in 37, 73 e 75 per cento della prole.

I simili risultati positivi sono stati raggiunti con TALEN e CRISPR-cas9 che modificano i sistemi.

Per confermare la trasmissione di germline, una certa prole knockout del ratto derivata dagli embrioni electroporated con ZFN mRNA con una larghezza di impulso di 1,5 spettrografie di massa è stata accoppiata con tipo selvaggio ratti e la generazione seguente di prole è stata analizzata. Hanno trovato che il loro metodo ha prodotto con successo la trasmissione di germline dell'espulsione del gene.

I ricercatori hanno concluso che il loro metodo era semplice ed efficace confrontato ai metodi di elettroporazione di convenzione che indeboliscono o eliminano la zona pellucida. L'uso dell'elettroporazione egualmente permette la generazione di animali knockout negli sforzi e le specie che non hanno stabilito le linee cellulari embrionali del gambo, che è necessario nei metodi convenzionali.

Riferimenti

  1. Elettroporazione: Un'alternativa al microinjection per la creazione dei roditori geneticamente modificati, https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/electroporation-an-alternative-to-microinjection-for-creating-genetically-modified-rodents
  2. Espulsione semplice dall'elettroporazione degli endonucleasi costruiti negli embrioni intatti del ratto, https://www.nature.com/articles/srep06382
  3. Consegna efficiente di DNA e dei morpholinos negli embrioni di preimplantation del mouse dall'elettroporazione, https://www.wsj.com/articles/the-real-reason-ford-is-phasing-out-its-sedans-1525369304

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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