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Electroporation e a produção de ratos do KO

Os ratos do KO são os animais que foram alterados genetically para de modo que uns ou vários genes não fossem expressados, ou “batidos para fora.” Os estudos são realizados então nos ratos para determinar o que os efeitos de uma perda do gene têm no animal, ou os efeitos das drogas e das outras terapias.

Crédito de imagem: unoL/Shutterstock
Crédito de imagem: unoL/Shutterstock

O gene que edita a tecnologia foi mostrado para ter vantagens sobre umas técnicas mais velhas da genética para produzir ratos do KO. O gene que edita as tecnologias que foram usadas com sucesso com esta finalidade inclui a nuclease do dedo do zinco (ZFN), transcrição activador-como a nuclease do effector (TALEN), e a nuclease palíndroma curto regularmente interspaced aglomerada (CRISPR) das repetições.

O sistema CRISPR-cas9 em particular transformou-se uma aproximação preferida para a engenharia do genoma do rato. A maneira usual de introduzir os componentes de CRISPR em embriões do rato para editar para fora ou bater um gene é pelo microinjection. Contudo, o microinjection exige um nível elevado de habilidade e é labor - intensivo porque os embriões devem ser injectados um de cada vez.

Mice "Tales"...the Knockout Mouse Production and Phenotyping Project

Uma técnica nova

Um método do electroporation foi desenvolvido pelos pesquisadores em Japão como uma alternativa para entregar o gene que editam elementos em um embrião chamado “técnica para o sistema animal do KO pelo Electroporation (a TOMADA).” Este método introduz eficientemente os reagentes em zygotes do rato sem a necessidade para habilidades de manipulação especiais e nenhum dano ao pellucida do zona (uma camada da glicoproteína que cerca a membrana de plasma) do embrião, como quase sempre acontece com electroporation convencional.

Os cientistas introduziram ZFN, TALEN, e CRISPR mRNA em embriões do rato usando o NEPA super 21 de Electroporator usando um sistema do pulso da três-etapa. Na primeira etapa, o pulso cria micro-furos na membrana do pellucida e de plasma do zona dos embriões. No passo seguinte, um grupo diferente de pulsos conduz o mRNA no citoplasma através dos micro-poros. Na terceira etapa, a polaridade é mudada para terminar transferência do mRNA nos embriões. Igualmente microinjected o mRNA para a comparação.

Resultados positivos

Após o electroporation, os embriões na fase de 2 pilhas foram transferidos em ratos fêmeas substitutos. Dez por cento dos embriões microinjected com o ZFN mRNA desenvolvido na prole, e 33 por cento daqueles tiveram a edição correcta do gene do alvo. Ao contrário, 31, 24, e 6 por cento dos embriões electroporated com a Senhora os 0,5 Senhoras, 1,5, e os 2,5 pulsos da Senhora desenvolvidos na prole, com edição correcta do gene do alvo em 37, 73, e 75 por cento da prole.

Os resultados positivos similares foram conseguidos com o TALEN e o CRISPR-cas9 que editam sistemas.

A fim confirmar a transmissão do germline, alguma prole do rato do KO derivada dos embriões electroporated com ZFN mRNA com uma largura de pulso de 1,5 Senhoras foi acoplada com o tipo selvagem ratos, e a próxima geração de prole foi analisada. Encontraram que seu método produziu com sucesso a transmissão do germline do KO do gene.

Os pesquisadores concluíram que seu método era simples e eficaz comparado aos métodos do electroporation da convenção que enfraquecem ou removem o pellucida do zona. O uso do electroporation igualmente permitem a geração de animais do KO nas tensões e a espécie que não estabeleceram linha celular embrionárias da haste, que é necessário em métodos convencionais.

Referências

  1. Electroporation: Uma alternativa ao microinjection para criar roedores genetically alterados, https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/electroporation-an-alternative-to-microinjection-for-creating-genetically-modified-rodents
  2. KO simples pelo electroporation de endonucleases projetados em embriões intactos do rato, https://www.nature.com/articles/srep06382
  3. Entrega eficiente de ADN e de morpholinos em embriões do preimplantation do rato pelo electroporation, https://www.wsj.com/articles/the-real-reason-ford-is-phasing-out-its-sedans-1525369304

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

Written by

Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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