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Electroporación y la producción de ratones Knockout

Los ratones Knockout son los animales para los cuales genético se han modificado para no expresar uno o más genes, o “se han golpeado fuera.” Los estudios entonces se realizan en los ratones para determinar lo que tienen los efectos de una baja del gen en el animal, o los efectos de drogas y de otras terapias.

Haber de imagen: unoL/Shutterstock
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El gen que corregía tecnología se ha mostrado para tener ventajas sobre más viejas técnicas de la ingeniería genética para producir ratones knockout. El gen que corrige las tecnologías que se han utilizado con éxito con este fin incluye la nucleasa del dedo del cinc (ZFN), transcripción activador-como nucleasa del determinante (TALEN), y nucleasa palindrómica corta regularmente interspaced agrupada (CRISPR) de las repeticiones.

El sistema CRISPR-cas9 particularmente se ha convertido en una aproximación preferida para la ingeniería del genoma del ratón. La manera usual de introducir los componentes de CRISPR en embriones del ratón para corregir o para eliminar un gen está por el microinjection. Sin embargo, el microinjection requiere un de alto nivel de la habilidad y es necesitando mucho trabajo porque los embriones deben ser inyectados uno a la vez.

Mice "Tales"...the Knockout Mouse Production and Phenotyping Project

Una nueva técnica

Un método de la electroporación ha sido desarrollado por los investigadores en Japón como opción para entregar el gen que corregían elementos en un embrión llamado “técnica para el sistema Knockout animal por la electroporación (la TOMA).” Este método introduce eficientemente los reactivos en zygotes del ratón sin la necesidad de habilidades de manejo especiales y de ningún daño al pellucida del zona (una capa de la glicoproteína que rodea la membrana de plasma) del embrión, como ocurre normalmente con la electroporación convencional.

Los científicos introdujeron ZFN, TALEN, y CRISPR mRNA en embriones de la rata usando el NEPA estupendo 21 de Electroporator usando un sistema del pulso del tres-paso. En el primer paso, el pulso crea los micro-orificios en la membrana del pellucida y de plasma del zona de los embriones. En el paso siguiente, un diverso equipo de pulsos impulsa el mRNA en el citoplasma a través de los microporos. En el tercer paso, la polaridad se cambia para terminar la transferencia del mRNA en los embriones. También microinjected el mRNA para la comparación.

Resultados positivos

Después de la electroporación, los embriones en el escenario de 2 células fueron transferidos en ratas femeninas sustitutas. El diez por ciento de embriones microinjected con ZFN mRNA desarrollado en descendiente, y el 33 por ciento de ésos tenían corregir correcto del gen del objetivo. En cambio, el 31, 24, y 6 por ciento de embriones electroporated con el ms 0,5 ms, 1,5, y 2,5 pulsos del ms desarrollados en descendiente, con corregir correcto del gen del objetivo en el 37, 73, y 75 por ciento del descendiente.

Los resultados positivos similares fueron logrados con TALEN y CRISPR-cas9 que corregían sistemas.

Para confirmar la transmisión del germline, aparearon a algún descendiente knockout de la rata derivado de los embriones electroporated con ZFN mRNA con una anchura de pulso de 1,5 ms con el tipo salvaje ratas, y la generación siguiente de descendiente era analizada. Encontraron que su método produjo con éxito la transmisión del germline del golpe de gracia del gen.

Los investigadores concluyeron que su método era simple y efectivo comparado a los métodos de la electroporación del convenio que debilitan o quitan el pellucida del zona. El uso de la electroporación también permite la generación de animales knockout en deformaciones y la especie que no han establecido variedades de células embrionarias del vástago, que es necesario en métodos convencionales.

Referencias

  1. Electroporación: Una opción al microinjection para crear los roedores genético modificados, https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/electroporation-an-alternative-to-microinjection-for-creating-genetically-modified-rodents
  2. Golpe de gracia simple por la electroporación de endonucleases dirigidos en los embriones intactos de la rata, https://www.nature.com/articles/srep06382
  3. Lanzamiento eficiente de la DNA y de los morpholinos en embriones del preimplantation del ratón por la electroporación, https://www.wsj.com/articles/the-real-reason-ford-is-phasing-out-its-sedans-1525369304

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

Written by

Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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