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Epitranscriptome ordonnançant des technologies

Un epitranscriptome est un ensemble de modifications fonctionellement appropriées d'ARN. Il y a presque cents modifications connues d'ARN ; la modification la plus courante dans l'ARNm interne est N6-methyladenosine (mA)6. Transférez RNAs (ARNt), ARNm, et RNAs ribosomique (ARNr) sont les trois types de RNAs qui sont goujon-transcriptionally modifié.

Helice d'ADN et d'ARN. Crédit : Andrii Vodolazhskyi/Shutterstock.com

À tous les organismes vivants, la traduction est un procédé principal. L'agencement et le fonctionnement du processus de traduction est très cher et il absorbe 40% d'énergie cellulaire, qui a mené au besoin de règlement strict de production de protéine dans beaucoup d'aspects.

Le règlement de la traduction est généralement lié au besoin des protéines réglées et non-réglées. Les modifications de nucléotide sont également importantes pour le processus de traduction. Des modifications de base d'ARN sont trouvées par des méthodes de ordonnancement appropriées.

À un niveau de génome, l'étude des mamans6 est possible avec l'aide des progrès récents en ordonnançant la technologie et le modèle des anticorps6 de mamans. Les technologies de ordonnancement sont cotées ci-après.

maman-ordonnancement6

Le m6A est la base la plus procurable dans l'ARNm eucaryotique. Le protocole de m6A peut être effectué sur l'ARNm. La première étape est d'acquérir une meilleure qualité d'échantillon d'ARN. L'ARN de Polyadenylated est amélioré par choix d'oligo-DT tandis que le protocole de m6A-seq est accompli par l'ARN. L'ARN de Polyadenylated est divisé en petits éclats avec une longueur 100 de NT chacun.

La fragmentation d'ARN de Polyadenylated est exécutée chimiquement pour réaliser la fragmentation efficace. Ces petits éclats sont employés pour ramener la définition à NT 200. Remapping de plus petits éclats dans le génome deviendrait pénible à cause davantage de fragmentation.

la Goujon-fragmentation, l'échantillon est mise par l'immunoprécipitation. Cette petite quantité d'ARNm réduit en fragments est maintenue de côté pour exécuter le procédé de contrôle d'entrée. Dans l'analyse de caractéristiques suivante, de petits éclats sont maintenus à l'état de niveau de la base. Le reste de l'échantillon immunoprecipitated en l'incubant avec de l'anticorps particulier de m6A qui tire des éclats contenant les résidus multiples de m6A.

Le talon recombiné d'agarose de la protéine A, qui peut gripper avec des anticorps, est employé pour incuber le mélange d'ARN-anticorps dans le procédé suivant. En conclusion, les éclats non liés sont supprimés, des éclats attachés sont retirés par l'ajout de m6A au mélange, et le composé de talon-anticorps-ARN déposé en forme solide.

Pendant la précipitation immunisée, les éclats et les talons d'ARN sont combinés ensemble faute d'anticorps. Des mesures d'analyse et de concentration de Bioanalyzer sont employées pour estimer la qualité du matériau dans tout le protocole restant. Le bon résultat peut être obtenu quand le produit de départ de meilleure qualité est employé.

MeRIP-ordonnancement

Là existent quelques différences entre les stratégies de ordonnancement et de MeRIP-ordonnancement de m6A. La principale différence est la catégorie du talon : Dynabeads magnétique sont employés dans MeRIP ordonnançant la stratégie, qui est d'abord appareillée avec des anticorps et ensuite combinée avec ribo-sans de l'ARN préparé. Ici, le procédé immunisé de précipitation est exécuté deux fois.

La composition de tampon impliquée dans la fragmentation diffère également. L'élution d'extraction par solvants est employée au lieu de l'élution de concurrence. Cependant, le concept principal impliqué dans ces deux méthodes est assimilé entre eux.

PA-m6A-sequencing

Le PA-m6A ordonnançant le nom a été inventé de m6A ordonnançant la stratégie en combination avec une PA ordonnançant la stratégie. Dans cette méthode, PA-m6A a la capacité de subir le mappage à haute résolution avec un transcriptome mammifère m6A. Il peut observer que les sites de modification de séquence de m6A plus exactement sont définis si comparés aux méthodes de ordonnancement conventionnelles. La définition a été réduite de 200 à NT 23.

La séquence de PA-m6A est polyvalente si comparée aux approches uniques de nucléotide. La réticulation ribonuclóside-améliorée de Photoactivatable et la stratégie de l'immunoprécipitation (PARCLIP) est la base pour la stratégie de PA-m6A. Dans la stratégie de PARCLIP, des ribonuclósides photoactivatable sont intégrés dans un ARNm et alors ils sont soumis au procédé d'immunoprécipitation. Il est assimilé au protocole de m6A, mais l'immunoprécipitation est exécutée avec de l'ARN intégral et alors ce l'ARN est goujon-réticulation réduite en fragments par l'irradiation uv.

Ordonnancement unique de molécule

L'ordonnancement unique de molécule a la capacité de fournir la définition de niveau de base des sites de m6A sans conclusion tirée sur la base du motif. La technologie en temps réel de molécule unique (SMRT) est la plate-forme la plus courante pour cette méthode d'ordonnancement.

Cette méthode a été développée par des biosciences et des technologies Pacifiques d'Oxford Nanopore. La surveillance continue du procédé, dans lequel l'ADN polymérase est intégré avec des nucléotides fluorescents, aide en trouvant l'information génétique et épigénétique en même temps.

Molécule unique ordonnançant des offres quelques avantages pendant qu'elle peut être employée pour trouver la modification d'ARN qui comprend des sites de m6A. La définition unique de nucléotide est de trouver les sites de m6A en ARN, qui est réalisée à l'aide de l'ADN polymérase plutôt que la transcriptase inverse.

Elle peut être employée comme enzyme dans un ZMW et pour permettre la synthèse directe de l'ADN complémentaire (ADNc) en temps réel. La transcription inverse apparaît aux vitesses normales. À l'instant de constitution de base, les sites conçus de m6A montrent l'accroissement important de la durée d'impulsions (IPD).

Méthodes uniques de nucléotide

Les techniques ci-dessus ne sont pas utiles dans le cas de déterminer la modification de niveau de nucléotide, due à une capacité inférieure de détermination. le clivage de Site-détail et le radioactif-marquage suivi de la méthode d'extraction ligature-aidée et de chromatographie en couche mince peuvent être employés pour surmonter ce désavantage. Par conséquent, la modification de m6A est non-stoechiométrique.

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Last Updated: Feb 26, 2019

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