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Epitranscriptome che ordina le tecnologie

Un epitranscriptome è un insieme delle modifiche dal punto di vista funzionale appropriate del RNA. Ci sono quasi cento modifiche conosciute di RNA; la modifica più comune in mRNA interno è N6-methyladenosine (mA)6. Trasferisca RNAs (tRNAs), mRNAs e RNAs ribosomiale (rRNAs) è i tre tipi di RNAs che sono post--transcriptionally modificati.

Elica del RNA e del DNA. Credito: Andrii Vodolazhskyi/Shutterstock.com

In tutti gli organismi viventi, la traduzione è un trattamento fondamentale. La disposizione e l'operazione del trattamento di traduzione è molto costose e consuma 40% di energia cellulare, che piombo all'esigenza del regolamento rigoroso di produzione della proteina in molti aspetti.

Il regolamento della traduzione è collegato generalmente con il bisogno delle proteine regolamentate e non regolamentate. Le modifiche del nucleotide sono egualmente importanti per il trattamento di traduzione. Le modifiche basse del RNA sono individuate con i metodi d'ordinamento appropriati.

Ad un livello del genoma, lo studio sul mA6 è possibile con l'aiuto degli avanzamenti recenti nell'ordinamento la tecnologia e della progettazione degli anticorpi6 di mA. Le tecnologie d'ordinamento sono elencate sotto.

mA-ordinamento6

Il m6A è la base più disponibile su mRNA eucariotico. Il protocollo di m6A può essere effettuato sul mRNA. Il primo punto è di acquistare una migliore qualità del campione del RNA. Il RNA di Polyadenylated è migliorato tramite la selezione oligo-distacco mentre il protocollo di m6A-seq è eseguito attraverso RNA. Il RNA di Polyadenylated è diviso nei piccoli frammenti con una lunghezza 100 del NT ciascuno.

La frammentazione del RNA di Polyadenylated è realizzata chimicamente per raggiungere la frammentazione efficiente. Questi piccoli frammenti sono usati per ridurre la risoluzione al NT 200. Remapping di più piccoli frammenti nel genoma diventerebbe noioso a causa di ulteriore frammentazione.

la Post-frammentazione, il campione è messa con immunoprecipitazione. Questa piccola quantità di mRNA spezzettato è conservata da parte per eseguire il trattamento di controllo dell'input. Nella seguente analisi di dati, i piccoli frammenti sono conservati a stato livellato di base. Il resto del campione immunoprecipitated incubandolo con un anticorpo particolare di m6A che tira i frammenti che contengono i residui multipli di m6A.

La perla recombinante dell'agarosi della proteina A, che può legare con gli anticorpi, è usata per incubare la miscela dell'RNA-anticorpo nel trattamento successivo. Per concludere, i frammenti non legati sono sradicati, i frammenti rilegati sono eliminati dall'aggiunta di m6A alla miscela e dal complesso del perla-anticorpo-RNA depositato nel modulo solido.

Durante l'immunoprecipitazione, i frammenti e le perle del RNA si combinano insieme in assenza degli anticorpi. Le misure dell'analisi e di concentrazione di Bioanalyzer sono usate per stimare la qualità del materiale in tutto il protocollo restante. Il buon risultato può essere ottenuto quando il prodotto base di migliore qualità è usato.

MeRIP-ordinamento

Esiste alcune differenze fra le strategie d'ordinamento e d'ordinamento di m6A. La differenza principale è la categoria di perla: Dynabeads magnetico è utilizzato in MeRIP che ordina la strategia, che in primo luogo è accoppiata con gli anticorpi e poi si combina con ribo-meno RNA trattato. Qui, il trattamento dell'immunoprecipitazione è eseguito due volte.

La composizione nel buffer in questione nella frammentazione egualmente differisce. L'eluizione dell'estrazione mediante solvente è usata invece dell'eluizione della concorrenza. Tuttavia, il concetto fondamentale in questione in questi due metodi è l'un l'altro simile.

PA-m6A-sequencing

Il PA-m6A che ordina il nome è stato punzonato da m6A che ordina la strategia congiuntamente ad un PA che ordina la strategia. In questo metodo, PA-m6A ha l'abilità di subire la mappatura ad alta definizione con un transcriptome mammifero m6A. Può essere osservato che i siti di modifica di sequenza di m6A sono definiti più esattamente una volta confrontati ai metodi d'ordinamento convenzionali. La risoluzione è stata diminuita da 200 al NT 23.

La sequenza di PA-m6A è versatile una volta confrontata ai singoli approcci del nucleotide. Photoactivatable ribonucleoside-ha migliorato la reticolazione e la strategia di immunoprecipitazione (PARCLIP) è la base per strategia di PA-m6A. Nella strategia di PARCLIP, i ribonucleosidi photoactivatable sono integrati in un mRNA e poi sono sottoposti al trattamento di immunoprecipitazione. È simile al protocollo di m6A, ma l'immunoprecipitazione è eseguita con RNA integrale e poi questo RNA è post-reticolazione spezzettata con l'irradiazione uv.

Sola sequenza della molecola

La sola sequenza della molecola ha la capacità di fornire la risoluzione del livello di base dei siti di m6A senza la conclusione tratta in base al motivo. La tecnologia in tempo reale della singola molecola (SMRT) è la piattaforma più comune per questo metodo di ordinamento.

Questo metodo è stato messo a punto dalle scienze biologiche e dalle tecnologie pacifiche di Oxford Nanopore. Il video continuo del trattamento, in cui la DNA polimerasi è integrata con i nucleotidi fluorescenti, aiuta nella rilevazione sia delle informazioni genetiche che epigenetiche allo stesso tempo.

Singola molecola che ordina le offerte alcuni vantaggi mentre può essere usata per individuare la modifica del RNA che include i siti di m6A. La singola risoluzione del nucleotide è di individuare i siti di m6A in RNA, che è raggiunto usando la DNA polimerasi piuttosto che il transcriptase inverso.

Può essere utilizzata come enzima all'interno di uno ZMW e nel permettere la sintesi complementare diretta del DNA (cDNA) nel tempo reale. La trascrizione inversa compare alle velocità standard. All'instante dell'incorporazione bassa, i siti progettati di m6A esibiscono la crescita importante della durata di interpulse (IPD).

Singoli metodi del nucleotide

Le tecniche di cui sopra non sono utili nel caso della determinazione della modifica livellata del nucleotide, dovuto una capacità più bassa della determinazione. la fenditura Sito-specifica e radioattivo-contrassegnare seguito dal metodo legatura-assistito di cromatografia su strato sottile e dell'estrazione possono essere usati per sormontare questo svantaggio. Di conseguenza, la modifica di m6A è non stechiometrica.

Sorgenti:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5215311/
  2. http://lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/002/216/982/RUG01-002216982_2015_0001_AC.pdf
  3. http://icmm.ku.dk/english/icmm-staff/henrik_nielsen/rna/research_projects/episeq/
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28032622
  5. https://news.uchicago.edu/article/2016/10/19/new-research-center-empower-study-novel-genetic-control-panel
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26121403

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Last Updated: Feb 26, 2019

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