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Epitranscriptome que arranja em seqüência tecnologias

Um epitranscriptome é um grupo de alterações funcional apropriadas do RNA. Há quase cem alterações conhecidas do RNA; a alteração a mais comum no mRNA interno é N6-methyladenosine (mA)6. Transfira RNAs (tRNAs), mRNAs, e RNAs ribosomal (rRNAs) é os três tipos de RNAs que são cargo-transcriptionally alterado.

Hélice do ADN e do RNA. Crédito: Andrii Vodolazhskyi/Shutterstock.com

Em todos os organismos vivos, a tradução é um processo fundamental. O regime e a operação do processo de tradução são muito caros e consome 40% da energia celular, que conduziu à necessidade para o regulamento restrito da produção da proteína em muitos aspectos.

O regulamento da tradução é relacionado geralmente à necessidade de proteínas reguladas e não-reguladas. As alterações do Nucleotide são igualmente importantes para o processo de tradução. As alterações baixas do RNA são detectadas por métodos arranjando em seqüência apropriados.

A nível do genoma, o estudo do miliampère6 é possível com a ajuda dos avanços recentes em arranjar em seqüência a tecnologia e o projecto de anticorpos6 do miliampère. As tecnologias arranjando em seqüência estão listadas abaixo.

miliampère-arranjar em seqüência6

O m6A é a base a mais disponível no mRNA eucariótica. O protocolo de m6A pode ser realizado no mRNA. A primeira etapa é adquirir uma qualidade melhor da amostra do RNA. O RNA de Polyadenylated está aumentado pela selecção oligo-descolamento quando o protocolo de m6A-seq for executado através do RNA. O RNA de Polyadenylated é dividido em fragmentos pequenos com um comprimento 100 de NT cada um.

A fragmentação do RNA de Polyadenylated é executada quimicamente para conseguir a fragmentação eficiente. Estes fragmentos pequenos são usados para reduzir a definição a NT 200. Remapping de fragmentos menores no genoma tornar-se-ia fastidioso devido a uma fragmentação mais adicional.

a Cargo-fragmentação, a amostra é passada com a imunoprecipitação. Esta pequena quantidade de mRNA fragmentado é retida de lado para executar o processo do controle da entrada. Na seguinte análise de dados, os fragmentos pequenos são retidos no estado nivelado básico. O resto da amostra immunoprecipitated incubando a com um anticorpo particular de m6A que puxe os fragmentos que contêm resíduos múltiplos de m6A.

O grânulo de recombinação do agarose da proteína A, que pode ligar com os anticorpos, é usado para incubar a mistura do RNA-anticorpo no processo subseqüente. Finalmente, os fragmentos desatados são erradicados, os fragmentos encadernados são removidos pela adição de m6A à mistura, e pelo complexo do grânulo-anticorpo-RNA depositado no formulário contínuo.

Durante a precipitação imune, os fragmentos e os grânulos do RNA são combinados junto na ausência dos anticorpos. As medidas da análise e da concentração de Bioanalyzer são usadas para calcular a qualidade do material durante todo o protocolo restante. O bom resultado pode ser obtido quando o material começar da melhor qualidade é usado.

MeRIP-arranjar em seqüência

Existe algumas diferenças entre estratégias arranjando em seqüência e MeRIP-arranjando em seqüência de m6A. A diferença principal é a categoria de grânulo: Dynabeads magnético é usado em MeRIP que arranja em seqüência a estratégia, que é emparelhada primeiramente com os anticorpos e combinada então com ribo-menos o RNA tratado. Aqui, o processo imune da precipitação é executado duas vezes.

A composição do amortecedor envolvida na fragmentação igualmente difere. A eluição da extracção solvente é usada em vez da eluição da competição. Contudo, o conceito fundamental envolvido nestes dois métodos é similar entre si.

PA-m6A-sequencing

O PA-m6A que arranja em seqüência o nome foi inventado de m6A que arranja em seqüência a estratégia em combinação com um PA que arranja em seqüência a estratégia. Neste método, PA-m6A tem a capacidade de submeter-se o traço de alta resolução com um transcriptome mamífero m6A. Pode-se observar que os locais da alteração da seqüência de m6A estão definidos mais exactamente quando comparados aos métodos arranjando em seqüência convencionais. A definição foi reduzida de 200 a NT 23.

A seqüência de PA-m6A é versátil quando comparada às únicas aproximações do nucleotide. Photoactivatable ribonucleoside-aumentou o ligamento transversal e a estratégia da imunoprecipitação (PARCLIP) é a base para a estratégia de PA-m6A. Na estratégia de PARCLIP, os ribonucleosides photoactivatable são integrados em um mRNA e são sujeitados então ao processo da imunoprecipitação. É similar ao protocolo de m6A, mas a imunoprecipitação é executada com o RNA completo do comprimento e então este RNA é cargo-ligamento transversal fragmentado com a irradiação UV.

Único arranjar em seqüência da molécula

Único arranjar em seqüência da molécula tem a capacidade para fornecer a definição nivelada baixa de locais de m6A sem a conclusão tirada com base no motivo. A única tecnologia do tempo real da molécula (SMRT) é a plataforma a mais comum para este método de arranjar em seqüência.

Este método foi desenvolvido por ciências biológicas e por tecnologias pacíficas de Oxford Nanopore. A monitoração contínua do processo, em que a polimerase de ADN é integrada com nucleotides fluorescentes, ajuda em detectar a informação genética e epigenética ao mesmo tempo.

Única molécula que arranja em seqüência ofertas algumas vantagens enquanto pode ser usada para detectar a alteração do RNA que inclui locais de m6A. A única definição do nucleotide é detectar os locais de m6A no RNA, que é conseguido usando a polimerase de ADN um pouco do que o transcriptase reverso.

Pode ser usada como uma enzima dentro de um ZMW e em permitir a síntese complementar directa do ADN (cDNA) no tempo real. A transcrição reversa aparece em velocidades padrão. No o instante da incorporação baixa, os locais projetados de m6A exibem o crescimento importante da duração dos impulsos (IPD).

Únicos métodos do nucleotide

As técnicas acima não são úteis no caso de determinar a alteração nivelada do nucleotide, devido a uma capacidade mais baixa da determinação. a segmentação Local-específica e a radioactivo-rotulagem seguido pelo método ligadura-ajudado da cromatografia da extracção e da fino-camada podem ser usadas para superar esta desvantagem. Conseqüentemente, a alteração de m6A é não-estoiquiométrica.

Fontes:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5215311/
  2. http://lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/002/216/982/RUG01-002216982_2015_0001_AC.pdf
  3. http://icmm.ku.dk/english/icmm-staff/henrik_nielsen/rna/research_projects/episeq/
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28032622
  5. https://news.uchicago.edu/article/2016/10/19/new-research-center-empower-study-novel-genetic-control-panel
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26121403

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Last Updated: Feb 26, 2019

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