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Epitranscriptome que ordena tecnologías

Un epitranscriptome es un equipo de modificaciones funcionalmente apropiadas del ARN. Hay casi cientos modificaciones sabidas del ARN; la modificación más común del mRNA interno es N6-methyladenosine (mA)6. Transfiera RNAs (tRNAs), mRNAs, y RNAs ribosomal (rRNAs) es los tres tipos de RNAs que son poste-transcriptionally modificado.

Hélice de la DNA y del ARN. Haber: Andrii Vodolazhskyi/Shutterstock.com

En todos los organismos vivos, la traslación es un proceso fundamental. La ordenación y la operación del proceso de traslación es muy costosas y consume el 40% de la energía celular, que ha llevado a la necesidad de la regla estricta de la producción de la proteína en muchos aspectos.

La regla de la traslación se relaciona generalmente con la necesidad de proteínas reguladas y no-reguladas. Las modificaciones del nucleótido son también importantes para el proceso de traslación. Las modificaciones bajas del ARN son descubiertas por métodos de secuencia apropiados.

En un nivel del genoma, el estudio del mA6 es posible con la ayuda de avances recientes en la secuencia de tecnología y del diseño de los anticuerpos6 del mA. Las tecnologías de secuencia son mencionadas abajo.

mA-secuencia6

El m6A es la base más disponible del mRNA eucariótico. El protocolo de m6A se puede realizar en el mRNA. El primer paso es detectar una mejor calidad de la muestra del ARN. El ARN de Polyadenylated es aumentado por la selección oligo-despegue mientras que el protocolo de m6A-seq se ejecuta a través del ARN. El ARN de Polyadenylated se divide en pequeños fragmentos con un largo 100 de NT cada uno.

La fragmentación del ARN de Polyadenylated se realiza químicamente para lograr la fragmentación eficiente. Estos pequeños fragmentos se utilizan para reducir la resolución a NT 200. El Remapping de fragmentos más pequeños en el genoma llegó a ser aburrido debido a la fragmentación adicional.

la Poste-fragmentación, la muestra se pasa con la inmunoprecipitación. Esta pequeña cantidad de mRNA hecho fragmentos se conserva a un lado para realizar proceso del mando de la entrada. En el análisis de datos siguiente, los pequeños fragmentos se conservan en el estado nivelado básico. El descanso de la muestra immunoprecipitated incubándola con un anticuerpo determinado de m6A que tire de los fragmentos que contienen residuos múltiples de m6A.

La moldura recombinante de la agarosa de la proteína A, que puede atar con los anticuerpos, se utiliza para incubar la mezcla del ARN-anticuerpo en el proceso subsiguiente. Finalmente, se suprimen los fragmentos desatados, los fragmentos encuadernados son quitados por la adición de m6A a la mezcla, y el complejo del moldura-anticuerpo-ARN depositado en forma sólida.

Durante la precipitación inmune, los fragmentos y las molduras del ARN se combinan juntas en ausencia de los anticuerpos. Las mediciones del análisis y de la concentración de Bioanalyzer se utilizan para estimar la calidad del material en el protocolo restante. El buen resultado puede ser obtenido cuando se utiliza la materia prima de una mejor calidad.

MeRIP-secuencia

Existen algunas diferencias entre las estrategias de secuencia y de MeRIP-secuencia de m6A. La diferencia principal es la categoría de la moldura: Dynabeads magnético se utiliza en MeRIP que ordena la estrategia, que primero se empareja con los anticuerpos y en seguida se combina con ribo-menos ARN tratado. Aquí, el proceso inmune de la precipitación se realiza dos veces.

La composición del almacenador intermedio implicada en la fragmentación también difiere. La elución de la extracción solvente se utiliza en vez de la elución de la competencia. Sin embargo, el concepto fundamental implicado en estos dos métodos es similar el uno al otro.

PA-m6A-sequencing

El PA-m6A que ordenaba nombre fue acuñado de m6A que ordenaba estrategia conjuntamente con un PA que ordenaba estrategia. En este método, PA-m6A tiene la capacidad de experimentar la correspondencia de alta resolución con un transcriptome mamífero m6A. Puede ser observado que los sitios de la modificación de la serie de m6A están definidos más exacto cuando están comparados a los métodos de secuencia convencionales. La resolución se ha reducido a partir del 200 a NT 23.

La serie de PA-m6A es versátil cuando está comparada a las únicas aproximaciones del nucleótido. Photoactivatable ribonucleósido-aumentó la reticulación y la estrategia de la inmunoprecipitación (PARCLIP) es la base para la estrategia de PA-m6A. En estrategia de PARCLIP, los ribonucleósidos photoactivatable son integrados en un mRNA y entonces se sujetan al proceso de la inmunoprecipitación. Es similar al protocolo de m6A, pero la inmunoprecipitación se realiza con ARN integral y entonces este ARN es poste-reticulación hecha fragmentos con la radiación ultravioleta.

Única secuencia de la molécula

La única secuencia de la molécula tiene la capacidad de ofrecer la resolución nivelada baja de los sitios de m6A sin la conclusión extraída en base de adorno. La tecnología en tiempo real de la única molécula (SMRT) es la plataforma más común para este método de secuencia.

Este método fue desarrollado por ciencia biológicas y las tecnologías pacíficas de Oxford Nanopore. El control continuo del proceso, en el cual la polimerasa de DNA se integra con los nucleótidos fluorescentes, ayuda en descubrir la información genética y epigenética al mismo tiempo.

Única molécula que ordena ofertas algunas ventajas mientras que puede ser utilizada para descubrir la modificación del ARN que incluye sitios de m6A. La única resolución del nucleótido es descubrir los sitios de m6A en el ARN, que se logra usando la polimerasa de DNA bastante que transcriptase reverso.

Puede ser utilizada como enzima dentro de un ZMW y en permitir síntesis complementaria directa de la DNA (cDNA) en tiempo real. La transcripción reversa aparece a las velocidades estándar. En instante de la incorporación baja, los sitios diseñados de m6A exhiben el incremento importante de la duración del impulso intermedio (IPD).

Únicos métodos del nucleótido

Las técnicas antedichas no son útiles en el caso de determinar la modificación nivelada del nucleótido, debido a una capacidad más inferior de la determinación. la hendidura Sitio-específica y la radioactivo-etiqueta seguido por método de la extracción ligadura-ayudada y de la cromatografía de capa delgada se pueden utilizar para vencer esta desventaja. Por lo tanto, la modificación de m6A es no-estequiométrica.

Fuentes:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5215311/
  2. http://lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/002/216/982/RUG01-002216982_2015_0001_AC.pdf
  3. http://icmm.ku.dk/english/icmm-staff/henrik_nielsen/rna/research_projects/episeq/
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28032622
  5. https://news.uchicago.edu/article/2016/10/19/new-research-center-empower-study-novel-genetic-control-panel
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26121403

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Last Updated: Feb 26, 2019

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