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Analyse d'Exosome utilisant la cytométrie de flux

L'analyse des exosomes a précédemment été due difficile à leur petite taille. La cytométrie de flux peut être employée pour trouver et caractériser des exosomes basés sur leurs bornes de surface de cellules.

exosomes étant relâchés d

Meletios Verras | Shutterstock

Quels sont des exosomes ?

Exosome sont une vésicule sécrétée de la membrane qui a un diamètre de 50-100nm. Ils sont impliqués dans plusieurs procédés qui concernent la transmission intercellulaire, telle que la métastase et la présentation des antigènes.

Exosomes sont présent en tous les fluides corporels, tels que le sang, l'urine etc. et agissent en tant que biomarqueurs pour les conditions modifiées et indigènes. Elles se composent de plusieurs bornes extérieures, telles que CD63, CD81, ALIX, et TSG101, qui peut être exploité pour la cytométrie de flux.

Préparation des échantillons

Les cellules dont des exosomes doivent s'analyser sont cultivées dans des medias essentiels jusqu'à ce qu'elles soient confluentes. Les cellules sont alors lavées avec des medias sans exosome pendant 72 heures avant les medias est rassemblées et filtrées pour enlever des cellules et des saletés.

Les medias est mélangés à du réactif exosome total d'isolement et du jour au lendemain incubés à 4°C. Par la suite, il est centrifugé et la boulette est lavée et filtrée avec PBS. En fin de compte, les taux de protéine et la taille des exosomes est déterminé.

Analyse quantitative des échantillons exosome

Pour effectuer une analyse quantitative des exosomes, le premier, une corrélation linéaire entre la moyenne intensité de fluorescence des talons et la concentration exosome doivent être déterminés. Déterminer une telle corrélation linéaire peut être très utile pour effectuer l'analyse quantitative des exosomes pendant que les méthodes existantes à mesurer ont besoin de le temps, instruments spécialisés, et sont encore FAUSSES. Une telle analyse linéaire fournit de grande précision pour des exosomes d'isolement dans un large éventail d'échantillons.

Dépistage d'Exosome en fluides biologiques

Suivre des méthodes de dépistage basées sur fluorescence, il est possible d'étudier analysent exosome directement des liquide organiques. C'est particulièrement utile car des exosomes sont de plus en plus identifiés comme bornes pour plusieurs maladies.

Le dépistage peut être exécuté directement sans purification ou concentration du reste de l'échantillon liquide. Cette méthode peut aider dans le dépistage des exosomes d'un échantillon qui peut être aussi peu que 25µl, autre introduisant l'utilisation de cette technique dans le diagnostic de la maladie.

Avantages de cytométrie de flux pour l'analyse exosome

La cytométrie de flux est une voie précise et reproductible d'analyser les échantillons cliniques et peut être employée pour étudier les caractéristiques matérielles et chimiques des cellules particulières. Les cytometers conventionnels de flux peuvent analyser les particules qui sont plus grandes que 300nm, basées sur la lumière dispersée avant (cellule d'appui-feu). Exosomes peut s'échelonner entre 100nm - 1000nm, et ainsi, des méthodes conventionnelles ne peut pas toujours être employé.

Là où les exosomes sont plus petits que 300nm, plus d'une méthode peut être effectuée comme l'analyse de rail de nanoparticle et la dispersion de la lumière dynamique. Des talons magnétiques enduits des anticorps vers CD63 (une borne pour des exosomes) ou les talons fluorescents peuvent également être employés pour trouver des exosomes dans des cytometers conventionnels.

Limitations des méthodes précédentes

La plupart des chercheurs commencent par 5-100ml des échantillons, et le volume de premier prélèvement peut affecter l'isolement et le dépistage de l'échantillon. Les méthodes principales employées dans ces buts ont été ultracentrifugation, tache occidentale, analyse de rail de nanoparticle, et microscopie électronique. Cependant, ces méthodes ont le potentiel inférieur de reproductibilité et de rendement de diagnostiquer ou exécuter la recherche clinique.

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Last Updated: Dec 20, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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