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Analisi di Exosome facendo uso di citometria a flusso

L'analisi dei exosomes precedentemente è stata difficile dovuto il loro di piccola dimensione. La citometria a flusso può essere usata per individuare e caratterizzare i exosomes basati sui loro indicatori della superficie delle cellule.

exosomes che sono rilasciati da una cella - da Meletios Verras

Meletios Verras | Shutterstock

Che cosa sono exosomes?

Exosome è una vescicola secernuta della membrana che ha un diametro di 50-100nm. Sono compresi in parecchi trattamenti che comprendono la comunicazione intercellulare, quale la presentazione di antigene e della metastasi.

Exosomes è presente in tutti i liquidi corporei, quali sangue, urina ecc e funge da biomarcatori per gli stati alterati ed indigeni. Consistono di parecchi indicatori di superficie, quali CD63, CD81, ALIX e TSG101, che può essere sfruttato per citometria a flusso.

Preparato del campione

Le celle da cui i exosomes devono essere analizzati sono coltivate nei media essenziali finché sono confluenti. Le celle poi sono lavate con i media senza exosome per 72 ore prima dei media è raccolta e filtrata per eliminare le celle ed i detriti.

I media è misti con il reagente exosome totale di isolamento ed è incubato a 4°C durante la notte. Successivamente, è centrifugato e la pallina è lavata e filtrata con PBS. Alla fine, i livelli della proteina e la dimensione dei exosomes è risoluti.

Analisi quantitativa dei campioni exosome

Per eseguire un'analisi quantitativa dei exosomes, la prima, una correlazione lineare fra l'intensità media della fluorescenza delle perle e la concentrazione exosome devono essere risolute. L'instaurazione della tale correlazione lineare può essere molto utile da eseguire l'analisi quantitativa dei exosomes mentre i metodi attuali da quantificare richiedono il tempo, strumenti specializzati e sono ancora inesatti. Tale analisi lineare fornisce l'alta precisione per i exosomes isolati da una vasta gamma di campioni.

Rilevazione di Exosome in liquidi biologici

Facendo uso ai dei metodi di rilevazione basati a fluorescenza, è possibile da studiare analizza exosome direttamente dai liquidi organici. Ciò è particolarmente utile poichè i exosomes sempre più stanno riconoscendi come indicatori per parecchie malattie.

La rilevazione può essere realizzata direttamente senza depurazione o concentrazione dal resto del campione liquido. Questo metodo può aiutare nella rilevazione dei exosomes da un campione che può essere così piccolo quanto 25µl, ulteriore promuovendo l'uso di questa tecnica nella diagnosi di malattia.

Vantaggi di citometria a flusso per analisi exosome

La citometria a flusso è un modo accurato e riproducibile di analizzare i campioni clinici e può essere usata per studiare le caratteristiche fisiche e chimiche delle celle particolari. I cytometers convenzionali di flusso possono analizzare le particelle che sono maggiori di 300nm, in base ad indicatore luminoso sparso di andata (FSC). Exosomes può variare fra 100nm - 1000nm e così, metodi convenzionali non può essere usato sempre.

Dove i exosomes sono più piccoli di 300nm, più di un metodo può essere effettuato quali l'analisi tenente la carreggiata di nanoparticella e lo scattering leggero dinamico. Le perle magnetiche ricoperte d'anticorpi verso CD63 (un indicatore per i exosomes) o le perle fluorescenti possono anche essere usate per individuare i exosomes in cytometers convenzionali.

Limitazioni dei metodi precedenti

La maggior parte dei ricercatori cominciano con 5-100ml dei campioni ed il volume di campione iniziale può pregiudicare l'isolamento e la rilevazione del campione. I metodi main usati per questi scopi sono stati l'ultracentrifugazione, macchia occidentale, l'analisi tenente la carreggiata di nanoparticella e microscopia elettronica. Tuttavia, questi metodi hanno potenziale basso di prestazione e della riproducibilità di diagnosticare o realizzare la ricerca clinica.

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Last Updated: Dec 20, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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