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Análise de Exosome usando o Cytometry de fluxo

A análise dos exosomes tem sido previamente difícil devido a seu tamanho pequeno. O cytometry de fluxo pode ser usado para detectar e para caracterizar os exosomes baseados em sua pilha surgir marcadores.

exosomes que estão sendo liberados de uma pilha - por Meletios Verras

Meletios Verras | Shutterstock

Que são exosomes?

Exosome é uma vesícula segregada da membrana que tem um diâmetro de 50-100nm. São envolvidos em diversos processos que envolvem uma comunicação intercellular, tal como a apresentação da metástase e de antígeno.

Exosomes esta presente em todos os líquidos corporais, tais como o sangue, a urina etc. e actua como biomarkers para estados alterados e nativos. Consistem em diversos marcadores de superfície, tais como CD63, CD81, ALIX, e TSG101, que pode ser explorado para o cytometry de fluxo.

Preparação da amostra

As pilhas de que os exosomes têm que ser analisados estão cultivadas em media essenciais até que forem confluentes. As pilhas são lavadas então com media exosome-livres por 72 horas antes dos media são recolhidas e filtradas para remover as pilhas e os restos.

Os media são misturados com o reagente exosome total do isolamento e incubados em 4°C durante a noite. Subseqüentemente, é centrifugado e a pelota é lavada e filtrada com PBS. Na extremidade, os níveis da proteína e o tamanho dos exosomes são determinados.

Análise quantitativa de amostras exosome

Para executar uma análise quantitativa dos exosomes, a primeira, uma correlação linear entre a intensidade média da fluorescência dos grânulos e a concentração exosome devem ser determinadas. Estabelecer tal correlação linear pode ser muito útil executar a análise quantitativa dos exosomes enquanto os métodos existentes a determinar exigem o tempo, instrumentos especializados, e são ainda imprecisos. Tal análise linear fornece a precisão alta para os exosomes isolados de uma vasta gama de amostras.

Detecção de Exosome em líquidos biológicos

Usando métodos de detecção fluorescência-baseados, é possível estudar analisa exosome directamente dos líquidos de corpo. Isto é especialmente útil porque os exosomes estão sendo reconhecidos cada vez mais como marcadores para diversas doenças.

A detecção pode ser executada directamente sem a purificação ou a concentração do resto da amostra líquida. Este método pode ajudar na detecção de exosomes de uma amostra que possa ser tão pouco quanto 25µl, mais adicional promovendo o uso desta técnica no diagnóstico da doença.

Vantagens do cytometry de fluxo para a análise exosome

O cytometry de fluxo é uma maneira exacta e reprodutível de analisar amostras clínicas e pode ser usado para estudar as características físicas e químicas de pilhas particulares. Os cytometers convencionais do fluxo podem analisar as partículas que são maiores do que 300nm, com base na luz dispersada dianteira (FSC). Exosomes pode variar entre 100nm - 1000nm, e assim, métodos convencionais não pode sempre ser usado.

Onde os exosomes são menores do que 300nm, mais de um método pode ser realizado como a análise de seguimento do nanoparticle e a dispersão de luz dinâmica. Os grânulos magnéticos revestidos com os anticorpos para CD63 (um marcador para exosomes) ou os grânulos fluorescentes podem igualmente ser usados para detectar exosomes em cytometers convencionais.

Limitações de métodos precedentes

A maioria de pesquisadores começam com o 5-100ml das amostras, e o volume de amostra inicial pode afectar o isolamento e a detecção da amostra. Os métodos principais usados para estas finalidades foram ultracentrifugation, mancha ocidental, análise de seguimento do nanoparticle, e microscopia de elétron. Contudo, estes métodos têm o baixo potencial da reprodutibilidade e de desempenho diagnosticar ou executar a pesquisa clínica.

Fontes:

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Last Updated: Dec 20, 2018

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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