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Análisis de Exosome usando Cytometry de flujo

El análisis de exosomes ha sido previamente difícil debido a su tamaño pequeño. El cytometry de flujo se puede utilizar para descubrir y para caracterizar los exosomes basados en sus marcadores de la superficie de la célula.

exosomes que son liberados de una célula - por Meletios Verras

Meletios Verras | Shutterstock

¿Cuáles son exosomes?

Exosome es una vesícula secretada de la membrana que tiene un diámetro de 50-100nm. Están implicados en varios procesos que impliquen la comunicación intercelular, tal como presentación de la metástasis y de antígeno.

Exosomes está presente en todos los líquidos corporales, tales como sangre, orina etc y actúa como biomarkers para los estados alterados y nativos. Consisten en varios marcadores superficiales, tales como CD63, CD81, ALIX, y TSG101, que se puede explotar para el cytometry de flujo.

Preparación de la muestra

Las células de las cuales los exosomes tienen que ser analizados se cultivan en ambientes esenciales hasta que son confluentes. Las células entonces se lavan con los ambientes exosome-libres por 72 horas antes de los ambientes cerco y se filtran para quitar las células y los escombros.

Los ambientes se mezclan con el reactivo exosome total del aislamiento y se incuban en 4°C durante la noche. Posteriormente, se centrifuga y la bolita se lava y se filtra con PBS. En el extremo, los niveles de la proteína y la talla de los exosomes es resueltos.

Análisis cuantitativo de muestras exosome

Para realizar un análisis cuantitativo de exosomes, el primer, una correlación lineal entre la intensidad media de la fluorescencia de las molduras y la concentración exosome deben ser resueltos. El establecimiento de tal correlación lineal puede ser muy útil para realizar el análisis cuantitativo de exosomes mientras que los métodos existentes a cuantificar requieren el tiempo, instrumentos especializados, y son todavía inexactos. Tal análisis lineal ofrece la alta exactitud para los exosomes aislados de una amplia gama de muestras.

Detección de Exosome en líquidos biológicos

Usando métodos de detección fluorescencia-basados, es posible estudiar analiza exosome directamente de los fluídos corporales. Esto es especialmente útil pues los exosomes se están reconociendo cada vez más como marcadores para varias enfermedades.

La detección se puede realizar directamente sin la purificación o la concentración del descanso de la muestra líquida. Este método puede ayudar en la detección de exosomes de una muestra que pueda ser tan poco como 25µl, más futura ascendiendo el uso de esta técnica en diagnosis de la enfermedad.

Ventajas del cytometry de flujo para el análisis exosome

El cytometry de flujo es una manera exacta y reproductiva de analizar muestras clínicas y se puede utilizar para estudiar las características físicas y químicas de células determinadas. Los cytometers convencionales del flujo pueden analizar las partículas que son mayores que 300nm, sobre la base de la luz dispersa delantera (FSC). Exosomes puede colocar entre 100nm - 1000nm, y así, los métodos convencionales no puede ser utilizado siempre.

Donde están más pequeños los exosomes que 300nm, más de un método se puede realizar por ejemplo análisis de búsqueda del nanoparticle y la dispersión luminosa dinámica. Las molduras magnéticas recubiertas con los anticuerpos hacia CD63 (un marcador para los exosomes) o las molduras fluorescentes se pueden también utilizar para descubrir exosomes en cytometers convencionales.

Limitaciones de métodos anteriores

La mayoría de los investigadores comienzan con 5-100ml de muestras, y el volumen de muestra inicial puede afectar al aislamiento y a la detección de la muestra. Los métodos principales usados para estos propósitos han sido ultracentrifugación, mancha blanca /negra occidental, análisis de búsqueda del nanoparticle, y microscopia electrónica. Sin embargo, estos métodos tienen potencial inferior de la reproductibilidad y de funcionamiento de diagnosticar o de realizar la investigación clínica.

Fuentes:

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Last Updated: Dec 20, 2018

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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