Systèmes de Deux-Hybride de FRETTE et de levure comparés

Le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) est une technique où deux molécules sensibles à la lumière transfèrent l'énergie à partir d'une molécule de distributeur à une molécule d'accepteur. Le résultat est émission d'un signe fluorescent par la molécule d'accepteur qui peut alors être trouvée.

Crédit : Caleb adoptif/Shutterstock.com

La FRETTE a beaucoup d'applications dans la biologie. Elle est très utilisée dans l'étude de la cinétique de réaction enzymique et comme système de dépistage dans des titrages de l'enzyme. Elle a été également employée pour étudier des interactions protéine-protéine.

La caractérisation des interactions protéine-protéine en cellules vivantes fournit l'analyse dans le système général de l'organisme. Le système du deux-hybride de levure (Y2H), initialement développé en 1989, est la méthode traditionnelle pour étudier des interactions protéine-protéine.

Méthodologie du deux-hybride de levure (Y2H)

La méthode de Y2H est basée sur des interactions de protéines en levure. Des protéines dans le système sont montrées amorce et proie. L'interaction entre les deux protéines active les gènes de journaliste qui activent l'accroissement sur un certain support ou un changement de couleur.

Des systèmes de Y2H ont été automatisés pour des études de haut-débit. Ils dépassent de loin les capacités des écrans plus tôt d'interaction, qui ne peuvent pas trouver des interactions in vivo.

L'utilisation des analyses de Y2H a été notamment employée pour construire le premier réseau de grande puissance d'interaction de protéines en levure. Des études assimilées ont été effectuées dans d'autres organismes.

Cependant, les analyses de Y2H ont un haut débit de faux positifs qui rendent l'évaluation de caractéristiques difficile. Dans quelques études, le régime des faux positifs a été plus de 50 pour cent. Y2H n'est également pas bien adapté pour capter la dynamique en temps réel dans des réseaux de protéine.

Comme alternative, la FRETTE a été adaptée pour des études d'interaction de protéines. Pour ces études, des protéines fluorescentes qui montrent la FRETTE sont génétiquement codées dans l'organisme d'hôte. Ces interactions peuvent alors être trouvées dans un grand choix de types de cellules.

Utilisant la FRETTE pour l'interaction de protéines les études surmonte certains des désavantages de la méthode plus ancienne de Y2H, tels que des faux positifs.

Interactomes de protéine

Tous les réseaux d'interaction de protéines dans un organisme sont connus comme interactome. La compréhension de l'interactome est essentielle pour définir des voies et trouver des traitements efficaces pour les maladies.

L'étude d'un interactome entier exige des méthodes plus sophistiquées que l'étude de différentes interactions de protéines. Y2H est avantageux pour ceci car il est simple, déterminé, et rentable. Il peut être employé dans l'examen critique de grande puissance ainsi que les plus petites études d'interaction de protéines. Il peut également être effectué in vivo.

Cependant, l'utilisation de la levure comme hôte signifie que des interactions d'autres organismes ne pourraient pas être trouvées. Ceci a pu être dû à l'expression faible ou à un mésappariement de modification goujon-de translation, ou à un manque de facteurs obligatoires.

Les deux protéines doivent pouvoir atteindre le noyau, ainsi protéines telles que les protéines liées par membrane qui ne sont pas libres pour écrire le noyau ne peuvent pas être étudiées correctement.

L'Overexpression des protéines dans des systèmes de Y2H peut mener aux interactions non spécifiques et à un régime faussement positif élevé. La lecture indirecte est un autre inconvénient de la méthode.

La FRETTE a quelques avantages pour des études d'interactome. Sa capacité de surveiller des interactions protéine-protéine en temps réel active la mesure même de la plupart de transitoire des interactions.

Elle peut également être employée en cellules sous tension et permet l'identification des sites d'interaction. Puisque les interactions fluorophore sont réversibles, la dynamique d'interaction complexe, telle que la dynamique d'équilibre, peut être surveillée.

La limitation de la FRETTE est que des fluorophores appropriés doivent être protégé par fusible aux protéines. Une lecture intense exige la proximité spatiale proche des fluorophores pour le transfert d'énergie.

La FRETTE a également la sensibilité inférieure comparée à quelques autres méthodes basées sur fluorescence dues à l'automatique-fluorescence de mouvement propre. Elle exige ainsi des expériences de contrôle de mesurer l'intensité de fluorescence.

Le procédé de la FRETTE, basé sur la transfecté de cellules avec des plasmides codant les protéines étiquetées fluorescentes. La PCP et le YFP sont employés comme donneur et accepteur, respectivement. Crédit : leogervasio/Youtube.com

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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