Sistemi dell'Due-Ibrido del lievito e del CERCHIO confrontati

Il trasferimento di energia di risonanza della fluorescenza (FRET) è una tecnica in cui due molecole sensibili alla luce trasferiscono l'energia proveniente da una molecola erogatrice ad una molecola del ricettore. Il risultato è emettenza di un segnale fluorescente dalla molecola del ricettore che può poi essere individuata.

Credito: Caleb adottivo/Shutterstock.com

Il CERCHIO ha molte applicazioni nella biologia. È ampiamente usato nello studio sulla cinetica di reazione enzimica e come sistema di rilevamento nelle analisi dell'enzima. Egualmente è stato usato per studiare le interazioni della proteina-proteina.

La caratterizzazione delle interazioni della proteina-proteina in celle viventi fornisce la comprensione nel sistema globale dell'organismo. Il sistema dell'due-ibrido del lievito (Y2H), originalmente messo a punto nel 1989, è il metodo tradizionale per lo studio delle interazioni della proteina-proteina.

Metodologia dell'due-ibrido del lievito (Y2H)

Il metodo di Y2H è basato sulle interazioni della proteina in lievito. Le proteine nel sistema sono designate esca e preda. L'interazione fra le due proteine attiva i geni del reporter che permettono alla crescita su un determinato media o su un cambiamento di colore.

I sistemi di Y2H sono stati automatizzati per gli studi di alto-capacità di lavorazione. Lontano superano le capacità degli schermi più in anticipo di interazione, che non possono individuare le interazioni in vivo.

L'uso delle analisi di Y2H è stato usato considerevolmente per costruire la prima rete su grande scala di interazione della proteina in lievito. I simili studi sono stati effettuati in altri organismi.

Tuttavia, le analisi di Y2H hanno un tasso alto di falsi positivi che rendono l'interpretazione di dati difficile. In alcuni studi, la tariffa dei falsi positivi è stata più di 50 per cento. Y2H non è egualmente ben adattato catturare la dinamica in tempo reale nelle reti della proteina.

Come alternativa, il CERCHIO si è adattato per gli studi di interazione della proteina. Per quegli studi, le proteine fluorescenti che esibiscono il CERCHIO geneticamente sono codificate nell'organismo ospite. Queste interazioni possono poi essere individuate in vari tipi delle cellule.

Facendo uso del CERCHIO per interazione della proteina gli studi sormonta alcuni degli svantaggi di più vecchio metodo di Y2H, quali i falsi positivi.

Interactomes della proteina

Tutte reti di interazione della proteina in un organismo sono conosciute come il interactome. La comprensione del interactome è cruciale per la definizione delle vie e l'individuazione delle terapie efficaci per le malattie.

Lo studio del interactome intero richiede i metodi complessi che lo studio sulle diverse interazioni della proteina. Y2H è vantaggioso per questo poichè è semplice, stabilito e redditizio. Può essere utilizzato nella selezione su grande scala come pure nei più piccoli studi di interazione della proteina. Può anche essere effettuato in vivo.

Tuttavia, l'uso di lievito come host significa che le interazioni da altri organismi non potrebbero essere individuate. Ciò ha potuto essere dovuto l'espressione difficile o un disadattamento di modifica post-di traduzione, o una mancanza di fattori obbligatori.

Entrambe le proteine devono potere accedere al nucleo, così proteine quali alle le proteine dirette a membrana che non sono libere di entrare nel nucleo non possono essere studiate correttamente.

La sovraespressione delle proteine nei sistemi di Y2H può piombo alle interazioni non specifiche e ad un'alta tariffa erroneamente positiva. La lettura indiretta è un altro svantaggio del metodo.

Il CERCHIO presenta alcuni vantaggi per gli studi del interactome. La sua capacità di riflettere le interazioni della proteina-proteina in tempo reale permette alla misura anche del più transitorio delle interazioni.

Può anche essere utilizzata nelle celle in tensione e permette l'identificazione dei siti di interazione. Poiché le interazioni fluorophore sono dinamica reversibile e complessa di interazione, quale la dinamica di equilibrio, può essere riflesso.

La limitazione del CERCHIO è che i fluorophores appropriati devono essere fusi alle proteine. Una forte lettura richiede la prossimità spaziale vicina dei fluorophores per il trasferimento di energia.

Il CERCHIO egualmente ha sensibilità più bassa confrontata ad alcuni altri a metodi basati a fluorescenza dovuto la automatico-fluorescenza di sfondo. Richiede così gli esperimenti di controllo di quantificare l'intensità della fluorescenza.

Il trattamento del CERCHIO, in base alle celle transfected con i plasmidi che codificano le proteine etichettate fluorescenti. Il CFP e YFP sono usati come il donatore e ricettore, rispettivamente. Credito: leogervasio/Youtube.com

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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