Sistemas do Dois-Híbrido da FRICÇÃO e do fermento comparados

Transferência de energia da ressonância da fluorescência (FRET) é uma técnica onde duas moléculas sensíveis à luz transferem a energia de uma molécula fornecedora a uma molécula do autómato. O resultado é emitância de um sinal fluorescente pela molécula do autómato que pode então ser detectada.

Crédito: Caleb adoptivo/Shutterstock.com

A FRICÇÃO tem muitas aplicações na biologia. É amplamente utilizada no estudo da cinética de reacção da enzima e como um sistema de detecção em ensaios de enzima. Foi usada igualmente para estudar interacções da proteína-proteína.

Caracterizar interacções da proteína-proteína em pilhas vivas fornece a introspecção no sistema total do organismo. O sistema do dois-híbrido do fermento (Y2H), desenvolvido originalmente em 1989, é o método tradicional para estudar interacções da proteína-proteína.

Metodologia do dois-híbrido do fermento (Y2H)

O método de Y2H é baseado em interacções da proteína no fermento. As proteínas no sistema são designadas isca e rapina. A interacção entre as duas proteínas activa os genes do repórter que permitem o crescimento em um determinado media ou em uma mudança da cor.

Os sistemas de Y2H foram automatizados para estudos da alto-produção. Excedem distante as capacidades de umas telas mais adiantadas da interacção, que não possam detectar interacções in vivo.

O uso de ensaios de Y2H foi usado notàvel para construir a primeira rede em grande escala da interacção da proteína no fermento. Os estudos similares foram realizados em outros organismos.

Contudo, os ensaios de Y2H têm uma taxa alta de falsos positivos que fazem a interpretação dos dados difícil. Em alguns estudos, a taxa de falsos positivos foi mais de 50 por cento. Y2H não é igualmente bom - serido para capturar a dinâmica do tempo real em redes da proteína.

Como uma alternativa, a FRICÇÃO foi adaptada para estudos da interacção da proteína. Para aqueles estudos, as proteínas fluorescentes que exibem a FRICÇÃO são codificadas genetically no organismo do anfitrião. Estas interacções podem então ser detectadas em uma variedade de tipos da pilha.

Usar a FRICÇÃO para estudos da interacção da proteína supera algumas das desvantagens do método mais velho de Y2H, tais como falsos positivos.

Interactomes da proteína

Todas as redes da interacção da proteína em um organismo são sabidas como o interactome. A compreensão do interactome é crucial para definir caminhos e encontrar terapias eficazes para doenças.

Estudar um interactome inteiro exige uns métodos mais sofisticados do que o estudo de interacções individuais da proteína. Y2H é vantajoso para este como é simples, estabelecido, e eficaz na redução de custos. Pode ser usado na selecção em grande escala assim como em estudos menores da interacção da proteína. Pode igualmente ser realizado in vivo.

Contudo, o uso do fermento como o anfitrião significa que as interacções de outros organismos não puderam ser detectadas. Isto podia ser devido à expressão deficiente ou a uma má combinação da alteração cargo-translational, ou a uma falta de factores obrigatórios.

Ambas as proteínas devem poder alcançar o núcleo, assim proteínas tais como as proteínas do membrana-limite que não estão livres incorporar o núcleo não podem ser estudadas correctamente.

O Overexpression das proteínas em sistemas de Y2H pode conduzir às interacções não específicas e a uma taxa alta do falso positivo. O readout indirecto é um outro inconveniente do método.

A FRICÇÃO tem algumas vantagens para estudos do interactome. Sua capacidade para monitorar interacções da proteína-proteína no tempo real permite a medida mesmo do mais transiente das interacções.

Pode igualmente ser usada em pilhas vivas e permite a identificação de locais da interacção. Porque as interacções fluoróforas são dinâmica reversível, complexa da interacção, tal como a dinâmica do equilíbrio, pode ser monitorado.

A limitação da FRICÇÃO é que os fluorophores apropriados precisam de ser fundidos às proteínas. Um readout forte exige a proximidade espacial próxima dos fluorophores para transferência de energia.

A FRICÇÃO igualmente tem uma mais baixa sensibilidade comparada a alguma outro os métodos fluorescência-baseados devido à auto-fluorescência do fundo. Exige assim experiências de controle determinar a intensidade da fluorescência.

O processo de FRICÇÃO, com base nas pilhas transfected com os plasmídeo que codificam proteínas etiquetadas fluorescentes. O CFP e YFP são usados como o doador e o autómato, respectivamente. Crédito: leogervasio/Youtube.com

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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