Sistemas del Dos-Híbrido del TRASTE y de la levadura comparados

La transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET) es una técnica en donde dos moléculas sensibles a la luz transfieren energía de una molécula dispensadora de aceite a una molécula del aceptor. El resultado es luminosidad de una señal fluorescente al lado de la molécula del aceptor que puede entonces ser descubierta.

Haber: Caleb adoptivo/Shutterstock.com

El TRASTE tiene muchos usos en biología. Es ampliamente utilizado en el estudio de la cinética de la reacción enzimática y como sistema de detección en análisis de enzima. También se ha utilizado para estudiar acciones recíprocas de la proteína-proteína.

Caracterizar acciones recíprocas de la proteína-proteína en células vivas ofrece discernimiento en el sistema total del organismo. El sistema del dos-híbrido de la levadura (Y2H), desarrollado originalmente en 1989, es el método tradicional para estudiar acciones recíprocas de la proteína-proteína.

Metodología del dos-híbrido de la levadura (Y2H)

El método de Y2H se basa en acciones recíprocas de la proteína en levadura. Las proteínas en el sistema se señalan cebo y presa. La acción recíproca entre las dos proteínas activa los genes del reportero que habilitan incremento en cierto ambiente o un cambio del color.

Los sistemas de Y2H se han automatizado para los estudios de la alto-producción. Exceden lejos las capacidades de pantallas anteriores de la acción recíproca, que no pueden descubrir acciones recíprocas in vivo.

El uso de los análisis de Y2H fue utilizado notablemente para construir la primera red en grande de la acción recíproca de la proteína en levadura. Los estudios similares se han realizado en otros organismos.

Sin embargo, los análisis de Y2H tienen una alta tasa de los positivos falsos que hacen la interpretación de los datos difícil. En algunos estudios, el índice de positivos falsos ha sido el más de 50 por ciento. Y2H no está también bien adaptado capturar dinámica en tiempo real en redes de la proteína.

Como opción, el TRASTE se ha adaptado para los estudios de la acción recíproca de la proteína. Para esos estudios, las proteínas fluorescentes que exhiben el TRASTE genético se codifican en el organismo del ordenador principal. Estas acciones recíprocas se pueden entonces descubrir en una variedad de tipos de la célula.

Usando el TRASTE para la acción recíproca de la proteína los estudios vencen algunas de las desventajas del más viejo método de Y2H, tales como positivos falsos.

Interactomes de la proteína

Todas las redes de la acción recíproca de la proteína en un organismo se conocen como el interactome. La comprensión del interactome es crucial para definir caminos y encontrar las terapias efectivas para las enfermedades.

Estudiar un interactome entero requiere métodos más sofisticados que el estudio de las acciones recíprocas individuales de la proteína. Y2H es ventajoso para esto como es simple, establecido, y de poco costo. Puede ser utilizado en la investigación en grande así como estudios más pequeños de la acción recíproca de la proteína. Puede también ser realizado in vivo.

Sin embargo, el uso de la levadura como ordenador principal significa que las acciones recíprocas de otros organismos no pudieron ser descubiertas. Esto podía ser debido a la expresión pobre o a un desequilibrio de impedancia de la modificación poste-de translación, o a una falta de factores obligatorios.

Ambas proteínas deben poder llegar hasta el núcleo, tan proteínas tales como proteínas del membrana-salto que no estén libres de incorporar el núcleo no se puedan estudiar correctamente.

El énfasis excesivo de proteínas en sistemas de Y2H puede llevar a acciones recíprocas no específicas y a un alto régimen falso-positivo. La lectura indirecta es otra desventaja del método.

El TRASTE tiene algunas ventajas para los estudios del interactome. Su capacidad de vigilar acciones recíprocas de la proteína-proteína en tiempo real habilita la medición incluso del más transitorio de acciones recíprocas.

Puede también ser utilizada en células vivas y permiso la identificación de los sitios de la acción recíproca. Porque las acciones recíprocas fluoróforas son dinámicas reversibles, complejas de la acción recíproca, tales como dinámica del equilibrio, puede ser vigilado.

La limitación del TRASTE es que los fluorophores apropiados necesitan ser fundidos a las proteínas. Una lectura fuerte requiere la proximidad espacial cercana de los fluorophores para la transferencia de energía.

El TRASTE también tiene sensibilidad más inferior comparada a algún otra los métodos fluorescencia-basados debido a la auto-fluorescencia del fondo. Requiere así experimentos de mando cuantificar intensidad de la fluorescencia.

El proceso del TRASTE, sobre la base de las células transfected con los plásmidos que codifican las proteínas marcadas con etiqueta fluorescentes. El CFP y YFP se utilizan como donante y aceptor, respectivamente. Haber: leogervasio/Youtube.com

Fuentes:

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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