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Chromatographie liquide de protéine rapide

La chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC) est, car le terme implique, une technique (rapide) efficace de chromatographie liquide pour la séparation des molécules de protéine. Le terme implique également que la phase mobile est un liquide ; la phase stationnaire est souvent une résine.

Dans cette méthode, une pompe est utilisée pour mettre à jour le flux de la phase mobile au régime désiré. La composition de l'éluant est variée à l'aide de différentes proportions des liquides qui composent l'éluant. Les conditions de la séparation sont mis à jour de telle manière que quand la composition des modifications d'éluant il y a une adsorption différentielle à la phase stationnaire des composantes de l'échantillon. L'optimisation de cette technique mène à la séparation des protéines et des peptides dans l'échantillon.

Une installation de laboratoire de FPLC. Mention de source : Kjaergaard /commons.wikimedia.org

Pourquoi cette technique ?

La chromatographie liquide à haute pression (HPLC) est souvent la méthode de choix pour la séparation des petites molécules. L'extraction et la purification des biomolécules, cependant, est provocante pour les raisons suivantes :

  • Elle fonctionne dans la plage de températures dans laquelle les organismes et les êtres humains survivent
  • Elle ne peut pas tolérer des températures élevées
  • Elle détruit leur structure ou fonctionnalité (ou les deux) dans l'environnement des solvants organiques utilisés dans la CLHP

Maintenant ces concepts dans l'esprit, Pharmacia a développé la technique de la chromatographie liquide de protéine rapide en 1982 pour fournir une méthode pour la séparation des biomolécules.

Quelques fonctionnalités de base de FPLC

L'objectif de FPLC est purification d'un biomolécule (biopolymère, protéine, peptide), la taille dont peut être plusieurs milliers Daltons. Le volume témoin peut s'échelonner d'environ 100 ml à plusieurs litres. De même que courant avec des biomolécules, l'éluant est un tampon, consécutivement souvent composé de deux tampons ou plus. Il est également important les composantes d'éluant utilisées sont biocompatible et ne réagissent pas avec la substance étant épurée (les exemples seraient teflon, titane, glace).

L'appareillage entier de chromatographie de FLP est employé souvent dans une chambre froide (ou à 4°C) de sorte que la structure de la protéine étant épurée ne soit pas dérangée. Pendant que les pressions utilisées sont souvent de l'ordre de quelques barres, la méthode désigné parfois sous le nom de la chromatographie liquide de support-pression ; et comme ceci est employé pour épurer des biomolécules, la technique également désignée sous le nom du biopurification ou le biochromatography.

La phase stationnaire dans FPLC est souvent une résine. L'échange ionique, la filtration sur gel, à phase renversée, et chromatographie d'affinité sont les modes courants utilisés dans le procédé de FPLC, et il y a également un large choix des résines procurables pour chacun de ces modes. Parfois, une combinaison de ces modes est employée. La première étape dans l'isolement d'une protéine d'un extrait brut est souvent chromatographie d'affinité. Ceci peut alors être sujet à la chromatographie d'échange ionique pour retirer des contaminants. Quand il n'est pas possible d'obtenir une protéine pure dans le pas de deux une troisième opération telle que la chromatographie d'ion-modification peut également être employée pour obtenir le produit pur final.

Le tampon utilisé comme phase mobile et le type de résine utilisé forment une paire. Supplémentaire et comme déjà mentionné, le tampon lui-même peut être un tampon de combinaison, composé d'un tampon en marche et d'un tampon d'élution. Quand le tampon en marche traverse un fléau chromatographique, l'échantillon est appliqué par une pompe témoin. Car l'échantillon traverse le fléau, la protéine d'intérêt est sélecteur adsorbée par la résine ; les autres composantes dans l'échantillon sortent simplement du système. Le gradient de tampon est alors changé en introduisant le tampon d'élution à l'aide des soupapes de tampon-mélange. Comme de plus en plus du tampon d'élution circule en fléau chromatographique, la protéine d'intérêt dissocie de la résine et sort avec le tampon d'éluant. La présence de la protéine dans l'éluant est confirmée par un détecteur qui mesure la concentration protéique.

Applications de FPLC

Liquide organiques tels que le plasma, urine, et les liquide céphalo-rachidiens contiennent un grand choix de protéines et de peptides, et FPLC a prouvé à être un rapide et fiable technique pour une étude des bornes en ces liquides. Le profil de lipoprotéine, par exemple, peut être obtenu par FPLC. Le profilage des protéines en liquide céphalo-rachidiens a été utile en trouvant des changements de la constitution du liquide dans des conditions de la maladie.

Pendant que des polynucléotides peuvent être également étudiées par FPLC, la technique a été employée pour la purification rapide de l'ARN et du plasmide ADN.

Le profilage de protéine de FPLC a été également employé dans la purification des venins animaux ainsi que dans le diagnostic de la bêta thalassémie. Son utilisation en recensant le microvariability dans une protéine unique est également vue pour avoir l'importance médicale.

FPLC a été employé assez considérable en analysant les constituants azotés de la bière, qui sont censés pour jouer un rôle dans la stabilité de la mousse.

La purification du déaminase de porphobilinogen des globules rouges humains, ainsi que la purification des anticorps et des vaccins pour différents buts, a été facilitée en employant FPLC.

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Last Updated: Jan 25, 2019

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