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Cromatografia a fase mobile liquida della proteina veloce

La cromatografia a fase mobile liquida della proteina veloce (FPLC) è, poichè il termine implica, un'efficace tecnica (veloce) di cromatografia a fase mobile liquida per la separazione di molecole di proteina. Il termine egualmente implica che la fase mobile sia un liquido; la fase stazionaria è spesso una resina.

In questo metodo, una pompa è utilizzata per mantenere il flusso della fase mobile alla tariffa desiderata. La composizione dell'eluente è variata usando le proporzioni differenti dei liquidi che compongono l'eluente. Gli stati della separazione sono mantenuti in tal modo che quando la composizione dei cambiamenti dell'eluente là è un adsorbimento differenziale alla fase stazionaria delle componenti del campione. L'ottimizzazione di questa tecnica piombo alla separazione di proteine e di peptidi nel campione.

Un'impostazione del laboratorio di FPLC. Credito di foto: Kjaergaard /commons.wikimedia.org

Perché questa tecnica?

La cromatografia a fase mobile liquida ad alta pressione (HPLC) è spesso il metodo di scelta per la separazione di piccole molecole. L'estrazione e la depurazione delle biomolecole, tuttavia, è provocatorie per le seguenti ragioni:

  • Funziona nella gamma di temperature all'interno di cui gli organismi e gli esseri umani sopravvivono a
  • Non può tollerare le temperature elevate
  • Perde la loro struttura o funzionalità (o entrambe) nell'ambiente dei solventi organici utilizzati nel HPLC

Tenendo questi concetti presente, Pharmacia ha sviluppato nel 1982 la tecnica di cromatografia a fase mobile liquida della proteina veloce per fornire un metodo per la separazione di biomolecole.

Alcune funzionalità di base di FPLC

Lo scopo di FPLC è depurazione di una biomolecola (biopolimero, proteina, peptide), la dimensione di cui può essere parecchie migliaia Daltons. Il volume di campione può variare da circa 100 ml a parecchi litri. Come è comune con le biomolecole, l'eluente è un buffer, a sua volta composto spesso di due o più buffer. È egualmente importante le componenti dell'eluente usate è biocompatibile e non reagisce con la sostanza che è depurata (esempi sarebbero teflon, titanio, vetro).

L'intera apparecchiatura della cromatografia di FLP è usata spesso in una cella frigorifera (o a 4°C) in moda da non disturbare la struttura della proteina che è depurata. Mentre le pressioni usate sono spesso nell'ordine di alcune barre, il metodo a volte si riferisce a come cromatografia a fase mobile liquida di media-pressione; e come questo è usato per la depurazione le biomolecole, la tecnica anche citata come biopurification o del biochromatography.

La fase stazionaria in FPLC è spesso una resina. La cromatografia in controfase e e di affinità di scambio ionico, di cromatografia d'esclusione, è i modi comuni utilizzati nel trattamento di FPLC e c'è egualmente un'ampia scelta delle resine disponibili per ciascuno di questi modi. A volte, una combinazione di questi modi è usata. Il primo punto nell'isolamento di una proteina da un estratto grezzo è spesso la cromatografia di affinità. Ciò può poi essere conforme alla cromatografia di scambio ionico per eliminare gli agenti inquinanti. Quando non è possibile ottenere una proteina pura in in due tappe un terzo punto quale la cromatografia del ione-cambiamento può anche essere usato per ottenere il prodotto puro definitivo.

Il buffer utilizzato come la fase mobile ed il tipo di resina usato formano un paio. Ulteriormente e come già citato, il buffer stesso può essere un buffer di combinazione, composto di un buffer corrente e di un buffer dell'eluizione. Quando il buffer corrente attraversa una colonna cromatografica, il campione si applica da una pompa del campione. Poichè il campione attraversa la colonna, la proteina di interesse è adsorbita selettivamente dalla resina; le altre componenti nel campione escono semplicemente dal sistema. Il gradiente del buffer poi è cambiato introducendo il buffer dell'eluizione per mezzo delle valvole dimescolamento. Come sempre più del buffer dell'eluizione sfocia nella colonna cromatografica, la proteina di interesse dissocia dalla resina ed esce con il buffer dell'eluente. La presenza della proteina nell'eluente è confermata da un rivelatore che misura la concentrazione nella proteina.

Applicazioni di FPLC

Liquidi organici quale plasma, urina ed i liquidi cerebrospinali contengono vari proteine e peptidi e FPLC è risultato essere un veloce ed affidabile tecnica per uno studio degli indicatori in questi liquidi. Il profilo della lipoproteina, per esempio, può essere ottenuto con FPLC. Il delineamento delle proteine in liquidi cerebrospinali è stato utile nella rilevazione dei cambiamenti nella costituzione del liquido nedegli stati di malattia.

Mentre i polinucleotidi possono anche essere studiati da FPLC, la tecnica è stata usata per la depurazione rapida di RNA e del DNA del plasmide.

Il delineamento della proteina di FPLC egualmente è stato utilizzato nella depurazione dei veleni animali come pure nella diagnosi della beta-talassemia. Il suo uso nell'identificazione del microvariability all'interno di singola proteina inoltre è veduto per avere importanza clinica.

FPLC è stato utilizzato equo estesamente nell'analizzare i componenti azotati della birra, che sono creduti per svolgere un ruolo nella stabilità della schiuma.

La depurazione della deaminasi di porphobilinogen dagli eritrociti umani come pure la depurazione degli anticorpi e dei vaccini per vari scopi, è stata facilitata mediante l'uso di FPLC.

Sorgenti

  1. https://www.researchgate.net/topic/Fast-Protein-Liquid-Chromatography
  2. https://www.quora.com/What-are-the-differences-between-FPLC-and-HPLC
  3. http://www.bio-rad.com/en-in/applications-technologies/fast-protein-liquid-chromatography
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20978981
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2308224
  6. https://www.slideshare.net/SafinaKouser/fplcfast-protein-liquid-chromatography
  7. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1992.tb01097.x/abstract
  8. http://fplc.weebly.com/hplc-and-fplc.html
  9. http://clinchem.aaccjnls.org/content/clinchem/29/9/1635.full.pdf
  10. https://www.researchgate.net/publication/261364739_Fast_Protein_Liquid_Chromatography
  11. http://fplc.weebly.com/uses.html
  12. https://books.google.co.in/books?id=MrHMeDmaLPwC&pg=PA10&dq=fast+protein+liquid+chromatography&hl=en&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=fast%20protein%20liquid%20chromatography&f=false
  13. https://books.google.co.in/books?id=EXTEjL2wTnYC&pg=PA147&dq=applications+of+fast+protein+liquid+chromatography&hl=en&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=applications%20of%20fast%20protein%20liquid%20chromatography&f=false
  14. https://books.google.co.in/books?id=hBO3N5qLTEIC&pg=PA218&lpg=PA218&dq=nitrogenous+constituents+in+beer&source=bl&ots=L6eXqvYR-u&sig=g7jUfwDFhGVxeijGi9jy7NoULM4&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwiXvabTzPTTAhWFqY8KHeGtASgQ6AEIOzAE#v=onepage&q=nitrogenous%20constituents%20in%20beer&f=false

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Last Updated: Jan 25, 2019

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