Aviso: Esta página é uma tradução automática da página original em inglês. Por favor note uma vez que as traduções são geradas por máquinas, não tradução tudo será perfeita. Este site e suas páginas da Web destinam-se a ler em inglês. Qualquer tradução deste site e suas páginas da Web pode ser imprecisas e imprecisos no todo ou em parte. Esta tradução é fornecida como uma conveniência.

Cromatografia líquida da proteína rápida

A cromatografia líquida da proteína rápida (FPLC) é, como o termo implica, uma técnica (rápida) eficaz da cromatografia líquida para a separação de moléculas de proteína. O termo igualmente implica que a fase móvel é um líquido; a fase estacionária é frequentemente uma resina.

Neste método, uma bomba é usada para manter o fluxo da fase móvel na taxa desejada. A composição do eluente é variada usando proporções diferentes dos líquidos que compo o eluente. As condições da separação estão mantidas de tal maneira que quando a composição das mudanças do eluente lá é uma adsorção diferencial à fase estacionária dos componentes da amostra. A optimização desta técnica conduz à separação de proteínas e de peptides na amostra.

Um laboratório estabelecido de FPLC. Crédito de foto: Kjaergaard /commons.wikimedia.org

Por que esta técnica?

A cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) é frequentemente o método de escolha para a separação de moléculas pequenas. A extracção e a purificação das biomoléculas, contudo, são desafiantes para as seguintes razões:

  • Funcionam na variação da temperatura dentro de que os organismos e os seres humanos sobrevivem
  • Não podem tolerar altas temperaturas
  • Perdem seus estrutura ou funcionalidade (ou ambos) no ambiente dos solventes orgânicos usados na HPLC

Mantendo estes conceitos na mente, Pharmacia desenvolveu a técnica da cromatografia líquida da proteína rápida em 1982 para fornecer um método para a separação de biomoléculas.

Algumas características básicas de FPLC

O objetivo de FPLC é purificação de uma biomolécula (biopolymer, proteína, peptide), o tamanho de que pode ser diverso mil Daltons. O volume de amostra pode variar de aproximadamente 100 ml a diversos litros. Como é comum com biomoléculas, o eluente é um amortecedor, por sua vez compo frequentemente de dois ou mais amortecedores. É igualmente importante os componentes do eluente usados é biocompatible e não reage com a substância que está sendo refinada (os exemplos seriam Teflon, titânio, vidro).

O instrumento inteiro da cromatografia de FLP é usado frequentemente em uma sala fria (ou em 4°C) de modo que a estrutura da proteína que está sendo refinada não seja perturbada. Enquanto as pressões usadas estão frequentemente na escala de algumas barras, o método está referido às vezes como a cromatografia líquida da media-pressão; e como isto é usado refinando biomoléculas, a técnica igualmente referiu como o biopurification ou o biochromatography.

A fase estacionária em FPLC é frequentemente uma resina. A troca iónica, filtragem de gel, inverteu - a fase, e a cromatografia de afinidade são os modos comuns usados no processo de FPLC, e há igualmente uma escolha larga das resinas disponíveis para cada um destes modos. Às vezes, uma combinação destes modos é usada. A primeira etapa no isolamento de uma proteína de um extracto bruto é frequentemente cromatografia de afinidade. Isto pode então ser sujeito à cromatografia da troca iónica remover os contaminadores. Quando não é possível obter uma proteína pura no pas-de-deux uma terceira etapa tal como a cromatografia da íon-mudança pode igualmente ser usada para obter o produto puro final.

O amortecedor usado como a fase móvel e o tipo de resina usado formam um par. Adicionalmente e como já mencionado, o amortecedor próprio pode ser um amortecedor da combinação, compo de um amortecedor running e de um amortecedor da eluição. Quando o amortecedor running corre através de uma coluna cromatográfica, a amostra está aplicada por uma bomba da amostra. Porque a amostra corre através da coluna, a proteína do interesse é fixada selectivamente pela resina; os outros componentes na amostra fluem simplesmente fora do sistema. O inclinação do amortecedor é mudado então introduzindo o amortecedor da eluição com a ajuda das válvulas demistura. Como cada vez mais do amortecedor da eluição flui na coluna cromatográfica, a proteína do interesse separa-se da resina e flui-se para fora com o amortecedor do eluente. A presença da proteína no eluente é confirmada por um detector que meça a concentração da proteína.

Aplicações de FPLC

Líquidos de corpo tais como o plasma, urina, e os líquidos cerebrospinais contêm uma variedade de proteínas e peptides, e FPLC provou ser um rápido e seguro técnica para um estudo dos marcadores nestes líquidos. O perfil da lipoproteína, por exemplo, pode ser obtido com FPLC. O perfilamento das proteínas em líquidos cerebrospinais foi útil em detectar mudanças na constituição do líquido em estados da doença.

Enquanto os polinucleotido podem igualmente ser estudados por FPLC, a técnica estêve usada para a purificação rápida do RNA e do ADN do plasmídeo.

O perfilamento da proteína de FPLC foi usado igualmente na purificação dos venenos animais assim como no diagnóstico do beta-thalassemia. Seu uso em identificar o microvariability dentro de uma única proteína é considerado igualmente para ter a importância clínica.

FPLC foi usado razoavelmente extensivamente em analisar os componentes nitrogenous da cerveja, que são acreditados para jogar um papel na estabilidade de espuma.

A purificação do deaminase do porphobilinogen dos eritrócites humanos, assim como a purificação dos anticorpos e das vacinas para várias finalidades, foram facilitadas pelo uso de FPLC.

Fontes

  1. https://www.researchgate.net/topic/Fast-Protein-Liquid-Chromatography
  2. https://www.quora.com/What-are-the-differences-between-FPLC-and-HPLC
  3. http://www.bio-rad.com/en-in/applications-technologies/fast-protein-liquid-chromatography
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20978981
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2308224
  6. https://www.slideshare.net/SafinaKouser/fplcfast-protein-liquid-chromatography
  7. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1992.tb01097.x/abstract
  8. http://fplc.weebly.com/hplc-and-fplc.html
  9. http://clinchem.aaccjnls.org/content/clinchem/29/9/1635.full.pdf
  10. https://www.researchgate.net/publication/261364739_Fast_Protein_Liquid_Chromatography
  11. http://fplc.weebly.com/uses.html
  12. https://books.google.co.in/books?id=MrHMeDmaLPwC&pg=PA10&dq=fast+protein+liquid+chromatography&hl=en&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=fast%20protein%20liquid%20chromatography&f=false
  13. https://books.google.co.in/books?id=EXTEjL2wTnYC&pg=PA147&dq=applications+of+fast+protein+liquid+chromatography&hl=en&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=applications%20of%20fast%20protein%20liquid%20chromatography&f=false
  14. https://books.google.co.in/books?id=hBO3N5qLTEIC&pg=PA218&lpg=PA218&dq=nitrogenous+constituents+in+beer&source=bl&ots=L6eXqvYR-u&sig=g7jUfwDFhGVxeijGi9jy7NoULM4&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwiXvabTzPTTAhWFqY8KHeGtASgQ6AEIOzAE#v=onepage&q=nitrogenous%20constituents%20in%20beer&f=false

Further Reading

Last Updated: Jan 25, 2019

Comments

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News Medical.