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Cromatografía líquida de la proteína rápida

La cromatografía líquida de la proteína rápida (FPLC) es, como el término implica, una técnica (rápida) efectiva de la cromatografía líquida para la separación de moléculas de proteína. El término también implica que la fase movible es un líquido; la fase estacionaria es a menudo una resina.

En este método, una bomba se utiliza para mantener el flujo de la fase movible al régimen deseado. La composición del eluyente se varía usando diversas proporciones de los líquidos que componen el eluyente. Las condiciones de la separación se mantienen de una manera tal que cuando la composición de los cambios del eluyente allí es una adsorción diferenciada a la fase estacionaria de los componentes de la muestra. La optimización de esta técnica lleva a la separación de proteínas y de péptidos en la muestra.

Un montaje del laboratorio de FPLC. Haber de foto: Kjaergaard /commons.wikimedia.org

¿Por qué esta técnica?

La cromatografía líquida de alta presión (HPLC) es a menudo el método de opción para la separación de pequeñas moléculas. La extracción y la purificación de biomoléculas, sin embargo, es desafiadoras por las razones siguientes:

  • Ella funciona en la gama de temperaturas dentro de la cual los organismos y los seres humanos sobreviven
  • Ella no puede tolerar temperaturas altas
  • Ella pierde su estructura o funciones (o ambas) en el ambiente de los disolventes orgánicos usados en CLAR

Teniendo estos conceptos presente, Pharmacia desarrolló la técnica de la cromatografía líquida de la proteína rápida en 1982 para ofrecer un método para la separación de biomoléculas.

Algunas características básicas de FPLC

La meta de FPLC es purificación de una biomolécula (biopolímero, proteína, péptido), la talla cuyo puede ser varios miles Daltons. El volumen de muestra puede colocar de cerca de 100 ml a varios litros. Al igual que común con las biomoléculas, el eluyente es un almacenador intermedio, a su vez compuesto a menudo de dos o más almacenadores intermedios. Es también importante los componentes del eluyente usados es biocompatible y no reacciona con la substancia que es purificada (los ejemplos serían Teflon, titanio, cristal).

El aparato entero de la cromatografía de FLP es de uso frecuente en una cámara fría (o en 4°C) para no perturbar la estructura de la proteína que es purificada. Mientras que las presiones usadas están a menudo en el rango de algunas barras, el método se refiere a veces como cromatografía líquida de la ambiente-presión; y como esto se utiliza para purificar biomoléculas, la técnica también designada el biopurification o el biochromatography.

La fase estacionaria en FPLC es a menudo una resina. La cromatografía del intercambio de iones, de la filtración de gel, inversa, y de afinidad es las maneras comunes usadas en el proceso de FPLC, y hay también una opción amplia de las resinas disponibles para cada uno de estas maneras. A veces, una combinación de estas maneras se utiliza. El primer paso en el aislamiento de una proteína de un extracto crudo es a menudo cromatografía de afinidad. Esto puede entonces estar conforme a la cromatografía de intercambio iónico para quitar los contaminantes. Cuando no es posible obtener una proteína pura en de dos etapas un tercer paso tal como cromatografía del ión-cambio se puede también utilizar para obtener el producto puro final.

El almacenador intermedio usado como la fase movible y el tipo de resina usado forman un par. Además y según lo mencionado ya, el almacenador intermedio sí mismo puede ser un almacenador intermedio de la combinación, compuesto de un almacenador intermedio corriente y de un almacenador intermedio de la elución. Cuando el almacenador intermedio corriente atraviesa una olumna de cromatografía, la muestra es aplicada por una bomba de la muestra. Pues la muestra atraviesa la olumna, la proteína del interés es adsorbida selectivamente por la resina; los otros componentes en la muestra salen a raudales simple del sistema. El gradiente del almacenador intermedio entonces es cambiado introduciendo el almacenador intermedio de la elución con la ayuda de las válvulas de almacenador-mezcla. Como del almacenador intermedio de la elución fluye cada vez más en la olumna de cromatografía, la proteína del interés disocia de la resina y fluye fuera con el almacenador intermedio del eluyente. La presencia de la proteína en el eluyente es confirmada por un detector que mida la concentración de la proteína.

Usos de FPLC

Fluídos corporales tales como plasma, orina, y los líquidos cerebroespinales contienen una variedad de proteínas y de péptidos, y FPLC ha demostrado ser un rápido y seguro técnica para un estudio de marcadores en estos líquidos. El perfil de la lipoproteína, por ejemplo, se puede obtener con FPLC. El perfilado de proteínas en líquidos cerebroespinales ha sido útil en descubrir cambios en la constitución del líquido en estados de la enfermedad.

Mientras que los polinucleótidos se pueden también estudiar por FPLC, la técnica se ha utilizado para la purificación rápida del ARN y de la DNA del plásmido.

El perfilado de la proteína de FPLC también se ha utilizado en la purificación de los venenos animales así como en la diagnosis de la beta-talasemia. Su uso en determinar microvariability dentro de una única proteína también se considera para tener importancia clínica.

FPLC se ha utilizado bastante extensivamente en analizar los componentes nitrogenados de la cerveza, que se creen para desempeñar un papel en estabilidad de la espuma.

La purificación de la desaminasa del porphobilinogen de eritrocitos humanos, así como la purificación de anticuerpos y de vacunas para los diversos propósitos, ha sido facilitada por el uso de FPLC.

Fuentes

  1. https://www.researchgate.net/topic/Fast-Protein-Liquid-Chromatography
  2. https://www.quora.com/What-are-the-differences-between-FPLC-and-HPLC
  3. http://www.bio-rad.com/en-in/applications-technologies/fast-protein-liquid-chromatography
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20978981
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2308224
  6. https://www.slideshare.net/SafinaKouser/fplcfast-protein-liquid-chromatography
  7. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1992.tb01097.x/abstract
  8. http://fplc.weebly.com/hplc-and-fplc.html
  9. http://clinchem.aaccjnls.org/content/clinchem/29/9/1635.full.pdf
  10. https://www.researchgate.net/publication/261364739_Fast_Protein_Liquid_Chromatography
  11. http://fplc.weebly.com/uses.html
  12. https://books.google.co.in/books?id=MrHMeDmaLPwC&pg=PA10&dq=fast+protein+liquid+chromatography&hl=en&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=fast%20protein%20liquid%20chromatography&f=false
  13. https://books.google.co.in/books?id=EXTEjL2wTnYC&pg=PA147&dq=applications+of+fast+protein+liquid+chromatography&hl=en&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=applications%20of%20fast%20protein%20liquid%20chromatography&f=false
  14. https://books.google.co.in/books?id=hBO3N5qLTEIC&pg=PA218&lpg=PA218&dq=nitrogenous+constituents+in+beer&source=bl&ots=L6eXqvYR-u&sig=g7jUfwDFhGVxeijGi9jy7NoULM4&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwiXvabTzPTTAhWFqY8KHeGtASgQ6AEIOzAE#v=onepage&q=nitrogenous%20constituents%20in%20beer&f=false

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Last Updated: Jan 25, 2019

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