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Cytometry de fluxo: Aproximações combinatórias à contagem de células

O cytometry de fluxo é uma técnica versátil da análise da pilha que possa ser usada para analisar tipos múltiplos da pilha. Combinar o cytometry de fluxo com as várias técnicas pode um aumento mais ulterior sua versatilidade e para fornecer uns dados mais detalhados. 

O cytometry de fluxo usa fluorophores para detectar pilhas para contarDavidBautista | Shutterstock

Os princípios de cytometry de fluxo e de contagem de células

Que é cytometry de fluxo?

O cytometry de fluxo é uma técnica que envolva passar as pilhas suspendidas em um líquido através de um laser, quando a dispersão da luz for detectada e processada no tempo real. O cytometry de fluxo igualmente mede a intensidade da fluorescência das pilhas. A informação ganhada do cytometry de fluxo pode ser usada para distinguir as várias características das pilhas, tais como o tamanho, a morfologia, os marcadores de superfície da pilha, íons intracelulares, expressão da proteína, índice do ADN, assim como várias funções homeostáticas.

O cytometry de fluxo pode ser usado para medir simultaneamente parâmetros múltiplos de uma pilha, que seja conseguida etiquetando parâmetros diferentes da pilha com os fluorophores diferentes. O cytometry de fluxo pode igualmente medir tipos diferentes da pilha do múltiplo simultaneamente, que é denominado ` que multiplexa'. Multiplexar é conseguida etiquetando os tipos diferentes da pilha com os fluorophores diferentes e pode ser usada para estudar genes, função da proteína, e o conjunto molecular nas pilhas.

Melhorias à contagem de células do cytometry de fluxo

A pilha fluorescente que barcoding permite que mais analytes sejam passados com o cytometer do fluxo, que aumenta a eficiência do cytometry de fluxo. Cada pilha passada com o cytometer do fluxo é etiquetada com um código de barras diferente da intensidade da fluorescência e do comprimento de onda da emissão.

Este método de barcoding foi usado para seleccionar bibliotecas das pilhas para inibidores da sinalização de célula T do receptor e do cytokine. Isto foi usado para testar para a eficácia e a selectividade de determinadas drogas em vários aspectos do sistema imunitário.

Usando somente três fluorophores diferentes, é possível analisar simultaneamente 96 analytes diferentes. Em conseqüência, aumentar o número de tinturas usadas aumentará o número de analytes possíveis exponencial.

Os cytometers múltiplos do fluxo do laser em combinação com pontas de prova novas e a instrumentação permitiram a emissão da fluorescência até 17 ser usados simultaneamente. Isto permite a análise de um grande número analytes, que podem dar séries de dados extremamente detalhadas e detalhadas.

Manipulação da amostra do cytometry de fluxo

Nos primeiros dias da análise do cytometry de fluxo, somente aproximadamente duas amostras pela acta eram favoráveis para a análise. Contudo, a investigação e desenvolvimento contínua do processo do cytometry de fluxo aumentou a produção do cytometry de fluxo, tornando o possível analisar tanto quanto 40-100 provam uma acta. Isto permite um grupo de 384 poços ser analisado cada 10 minutos. As concentrações da pilha da entrada para esta são 1-20 milhão pilhas pelo mililitro, com uma escala de 4 décadas da intensidade da fluorescência

A produção alta do cytometry de fluxo permitiu séries de dados em processos muito específicos da pilha ser feita (por exemplo ligante e interacções proteína-acopladas G do receptor e a sinalização resultante).

Combinando o cytometry de fluxo com outras técnicas da análise da pilha

Combinando o cytometry de fluxo e o cytometry em massa

O cytometry de fluxo e o cytometry em massa foram usados junto para analisar pilhas para biomarkers do enxerto crônico contra a doença do anfitrião (cGVHD). Para essa finalidade, o sangue foi tomado dos pacientes que exibem o cGVHD e as pilhas mononuclear do sangue periférico (PBMCs) foram removidas do plasma e manchadas então.

Um total de 44 anticorpos para vários marcadores do cGVHD foi usado durante este estudo. Após ter manchado o PBMCs foram analisados usando a classificação fluorescência-ativada da pilha (que é um tipo especializado de cytometry de fluxo).

As amostras de PMBC dos pacientes foram tratadas com os vários produtos químicos antes de ser analisada usando o cytometry em massa. Os dados do cytometry de fluxo e do cytometry em massa foram analisados para avaliar o estado do cGVHD dos pacientes. A análise encontrou que os níveis inferiores de pilhas de T mucosa-associadas estiveram considerados nos pacientes com cGVHD severo.

Por outro lado, os pacientes com cGVHD moderado e severo mostraram uma população de célula T activa mais alta e uma expressão mais alta dos chemokines e dos cytokines envolvidos em uma resposta imune activa. Os resultados desta análise ajudarão no cGVHD compreensivo e em fornecer melhores opções do tratamento para ele.

Combinando o cytometry de fluxo e a citologia fina da aspiração da agulha

A análise do cytometry de fluxo e a citologia fina da aspiração da agulha (FNAC) foram usadas para diagnosticar e classificar o linfoma non-Hodgkin (NHL). Em um estudo, as manchas de FNAC foram preparadas e manchadas. O material foi recolhido então para immunophenotyping cytometric do fluxo (FCI), quando as amostras foram processadas e um painel dos anticorpos foi usado para immunotyping. Os resultados da citologia e os dados de FCI foram analisados na junção para diagnosticar e classificar o NHL de acordo com as classificações existentes.

O material recolhido para FCI foi usado igualmente para a análise do cytometry de fluxo da duplo-cor. Este material foi preparado e etiquetado com os dois fluorophores diferentes, e os anticorpos para várias proteínas do CD foram usados. A análise de todos os dados recolhidos permitiu 79% das caixas do NHL analisadas secundário-para ser classificado.

As subclasses incluíram o linfoma linfático pequeno da pilha, o linfoma da pilha da cornija de lareira, e o grande linfoma de B, assim como o muito outro, que é extremamente importante para o campo da hematologia.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Mar 26, 2019

Written by

Samuel Mckenzie

Sam graduated from the University of Manchester with a B.Sc. (Hons) in Biomedical Sciences. He has experience in a wide range of life science topics, including; Biochemistry, Molecular Biology, Anatomy and Physiology, Developmental Biology, Cell Biology, Immunology, Neurology  and  Genetics.

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