Méthodologie de cytométrie de flux, utilisations, et analyse de caractéristiques

La cytométrie de flux est employée pour déterminer les propriétés matérielles et chimiques des cellules dans une population hétérogène. Suivre cette méthode, des paramètres multiples des cellules peuvent s'analyser simultanément. Cet article décrit les principes fondamentaux de la cytométrie de flux, c'est des applications et comment des caractéristiques de cytométrique peuvent s'analyser.

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Image des cellules et des anticorps qui pourraient sDesign_Cells | Shutterstock

Principes fondamentaux de cytométrie de flux

La cytométrie de flux est employée quand il y a un besoin de profiler un grand nombre de cellule différente saisit une population. Les cellules sont séparées sur la base des différences dans la taille et de la morphologie. Supplémentaire, des anticorps fluorescent-étiquetés qui visent des antigènes spécifiques sur la surface de cellules peuvent être employés pour recenser et isoler les sous-populations variées.

Les opérations fondamentales comprennent réussir les cellules par une glissière étroite, telle que chaque cellule est illuminée par un laser un par un. Une suite de détecteurs trouve alors la lumière réfractée ou émise, et cette caractéristique est intégrée et compilée pour produire des informations sur l'échantillon.

Que la cytométrie de flux peut-elle être employée pour mesurer ?

La cytométrie de flux aide à analyser plusieurs paramètres d'une cellule simultanément. Certains de ces paramètres sont décrits ci-dessous :

Analyse fonctionnelle

Cette méthode peut déterminer l'activité biologique à l'intérieur des cellules, telles que le rétablissement des espèces réactives de l'oxygène, des modifications mitochondriales de membrane pendant l'apoptose, des régimes de phagocytose dans les bactéries marquées, de la teneur en calcium indigène, et du teneur changeant en métal en réponse de réaction aux médicaments, etc.

Détermination de la viabilité de cellules

Cette méthode peut également être employée pour évaluer la viabilité de cellules après l'ajout des organismes ou des médicaments pathogènes. N'importe quelle infraction dans l'intégrité de membrane cellulaire peut être déterminée utilisant les teintures qui peuvent écrire la membrane cellulaire crevée. Les sondes fluorescentes telles que BRI-oxonol peuvent gripper aux protéines actuelles sur la membrane cellulaire, laissant pour l'identification des étapes variées de la nécrose.

Apoptose de mesure et nécrose

L'apoptose ou la mort cellulaire programmée est accompagné des changements caractéristiques de la forme de cellules, de la perte de structures, du détachement de cellules, de la condensation du cytoplasme, du rétrécissement de cellules, de la phagocytose des résidus cellulaires et des changements de l'enveloppe nucléaire.

Certaines des modifications biologiques comprennent la protéolyse, la dénaturation d'ADN, la déshydratation de cellules, l'édition absolue de protéine, et une augmentation dans les ions calcium libres. Ces l'examen médical et les modifications biologiques peuvent être trouvés utilisant la cytométrie de flux.

Oncosis est un événement nécrotique où la cellule commence à gonfler plutôt que rétrécissent. Ceci mène à la rupture de la membrane de plasma et du desserrage des enzymes protéolytiques qui peuvent également endommager les tissus environnants. Ces changements de la forme de membrane et de cellules de plasma peuvent être évalués utilisant la cytométrie de flux.

Analyse de cycle cellulaire

La quantité d'ADN actuelle au noyau varie pendant chaque phase du cycle cellulaire. Cette variation de teneur d'ADN peut être évaluée utilisant les teintures fluorescentes qui grippent à l'ADN ou aux anticorps monoclonaux, qui peuvent permettre le dépistage de l'expression d'antigène.

D'autres facteurs comprenant la teneur des pigments de cellules tels que la variation de numéro de chlorophylle, de copie d'ADN, les antigènes intracellulaires, l'activité enzymatique, les paquets d'impulsions oxydants, le glutathion, et l'adhérence de cellules peuvent assimilé être mesurés suivre cette méthode.

Comment les cytometers de flux fonctionnent-ils ?

Fluidique

Pendant la cytométrie de flux, un liquide d'étui oriente hydrodynamiquement la suspension de cellules par un petit gicleur tels que seulement une cellule réussit la lumière laser à la fois. Un détecteur est mis devant le faisceau laser tels qu'il peut capter la lumière dispersée avant des cellules, alors que plusieurs détecteurs sont également mis aux côtés pour mesurer la valeur et l'intensité de la lumière dispersées dans chaque sens.

La diffusion vers l'avant se rapporte à la lumière réfractée par une cellule qui se déplace dans le même sens qu'elle se déplaçait initialement. La proportion de la lumière qui est vers l'avant dispersée est marquée avec la taille de cellules, où de plus grandes particules produisent la lumière dispersée plus avant.

La diffusion latérale se rapporte à la lumière réfractée qui est orthogonale au sens du circuit léger. La lumière dispersée par côté fournit des informations au sujet de la granularité, où les cellules hautement granulaires produisent plus de comparé léger côté-dispersé aux cellules avec la granularité inférieure.

Par exemple, tout en exécutant la cytométrie de flux des prises de sang, les grands et granulaires polynucléaires montrent une diffusion latérale avant et élevée ; monocytes qui sont grande mais non granulaire exposition une diffusion latérale avant mais inférieure élevée. Ainsi, basé sur la proportion de la lumière qui est les types dispersés et différents avant et latéraux de populations peut être séparé.

Séparation basée sur l'émission de fluorescence

Indépendamment de la diffusion latérale avant et, différents types de cellules peuvent également être séparés ont basé sur la lumière émise par les molécules fluorescentes. Cette fluorescence peut être due aux matériaux brillants par fluorescence naturellement à l'intérieur d'une cellule, ou aux anticorps fluorescence-étiquetés. Par exemple, le fluorochrome est employé pour souiller une protéine d'intérêt de sorte que la lumière laser d'incident de la longueur d'onde appropriée permette les cellules contenant cette protéine à trouver.

Pendant qu'une cellule traverse le faisceau laser, un pouls d'émission de photon est produit. Ce pouls est trouvé par le tube photomultiplicateur et converti en impulsion de tension, qui peut être interprétée par le cytometer de flux. Plus l'intensité de la fluorescence est élevée, plus l'impulsion de tension est élevée.

Évaluation de caractéristiques

Chaque cellule qui traverse la lumière laser est trouvée comme événement indépendant. En outre, différents types de lumière trouvée : transhorizon, côté-dispersion, et longueurs d'onde spécifiques d'émission de fluorescence, est affecté une glissière distincte. La caractéristique pour chacun de ces événements est tracée indépendamment et peut être représentée par deux méthodes : histogrammes et point-plots.

Les histogrammes comparent un paramètre unique, où l'intensité est tracée sur un axe et le nombre d'événements est tracé sur un axe indépendant. les Point-plots peuvent comparer plus d'un paramètre simultanément, où chaque événement est manifesté pendant que des valeurs uniques et d'intensité de deux ou trois glissières sont représentées sur l'axe varié.

Dans ce scénario, les événements qui ont assimilé des intensités groupent ensemble dans le plot de point. Tandis que les point-plots peuvent comparer des paramètres multiples ensemble, il est plus facile s'afficher et comprendre des histogrammes. Dans de nombreux cas, les point-plots et les histogrammes ne sont pas mutuellement - l'exclusivité, et dans beaucoup d'expériences de cytométrie de flux les deux types de graphiques sont tracées pour représenter et évaluer des caractéristiques multi-paramétriques.

Déclenchement en cytométrie de flux

Le déclenchement est une méthode employée en cytométrie de flux où plus d'informations sont préférentiellement collectées au sujet d'une certaine sous-population des cellules. Ceci ajoute davantage de définition à la cytométrie de flux et peut être employé pour analyser des paramètres multiples.

Dans une expérience déclenchée de cytométrie de flux, la caractéristique est rassemblée au sujet d'un ou plusieurs glissières du point-plot. Puis, un cadre de grille est entraîné et une sous-population des cellules sont sélectées pour plus d'analyse. Cette sous-population est mise en valeur dans d'autres plots qui manifestent l'information des glissières alternes. Cette méthode aide à fournir une souplesse plus grande et une définition unicellulaire pour chaque glissière.

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Last Updated: Jun 28, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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