Metodologia di citometria a flusso, usi ed analisi di dati

La citometria a flusso è usata per determinare i beni fisici e chimici delle celle in una popolazione eterogenea. Facendo uso di questo metodo, i parametri multipli degli unicellulari possono essere analizzati simultaneamente. Questo articolo descrive i principi di base di citometria a flusso, è le applicazioni e come i dati cytometric possono essere analizzati.

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Immagine delle celle e degli anticorpi che potrebbero essere analizzati facendo uso di citometria a flusso.Design_Cells | Shutterstock

Principi di base di citometria a flusso

La citometria a flusso è usata quando c'è una necessità di profilare tantissima cella differente digita dentro una popolazione. Le celle sono separate in base alle differenze nella dimensione e nella morfologia. Ulteriormente, gli anticorpi fluorescente-etichettati che mirano agli antigeni specifici sulla superficie delle cellule possono essere usati per identificare e segregare le varie sottopopolazioni.

I passaggi fondamentali comprendono passare le celle attraverso un canale stretto, tale che ogni cella è illuminata da un laser uno alla volta. Una serie di sensori poi individua l'indicatore luminoso rifranto o emesso e questi dati sono integrati e compilati per generare le informazioni sul campione.

Che cosa può la citometria a flusso essere usata per misurare?

La citometria a flusso contribuisce ad analizzare simultaneamente parecchi parametri di una cella. Alcuni di questi parametri sono descritti qui sotto:

Analisi funzionale

Questo metodo può determinare l'attività biologica dentro le celle, quale la generazione di specie reattive dell'ossigeno, di cambiamenti mitocondriali della membrana durante il apoptosis, di tariffe della fagocitosi in batteri contrassegnati, di contenuto indigeno del calcio e di contenuto cambiante del metallo nella risposta di risposta le droghe, ecc.

Determinazione dell'attuabilità delle cellule

Questo metodo può anche essere usato per valutare l'attuabilità delle cellule dopo l'aggiunta degli organismi o delle droghe patogeni. Tutta la violazione nell'integrità della membrana cellulare può essere risoluta facendo uso delle tinture che possono entrare nella membrana cellulare perforata. Le sonde fluorescenti quale Banca dei Regolamenti Internazionali-oxonol possono legare alle proteine presenti sulla membrana cellulare, concedendo per l'identificazione di varie fasi di necrosi.

Apoptosis e necrosi di misurazione

Il Apoptosis o la morte programmata delle cellule è accompagnato dai cambiamenti caratteristici nella forma delle cellule, nella perdita di strutture, nella separazione delle cellule, nella condensazione del citoplasma, nel restringimento delle cellule, nella fagocitosi dei residui cellulari e nei cambiamenti nella busta nucleare.

Alcuni dei cambiamenti biochimici comprendono la proteolisi, la denaturazione del DNA, la disidratazione delle cellule, la proteina checollegano e un aumento negli ioni liberi del calcio. Questi cambiamenti fisici e biochimici possono essere individuati facendo uso di citometria a flusso.

Oncosis è un evento necrotico dove la cella comincia gonfiare piuttosto che si restringe. Ciò piombo alla rottura della membrana di plasma e della versione degli enzimi proteolitici che possono anche danneggiare i tessuti circostanti. Questi cambiamenti nella forma della membrana e delle cellule di plasma possono essere valutati facendo uso di citometria a flusso.

Analisi del ciclo cellulare

La quantità di DNA presente nel nucleo varia durante l'ogni fase del ciclo cellulare. Questa variazione nel contenuto del DNA può essere valutata facendo uso delle tinture fluorescenti che legano a DNA o agli anticorpi monoclonali, che possono permettere la rilevazione dell'espressione dell'antigene.

Altri fattori compreso il contenuto dei pigmenti delle cellule quali la variazione di numero di copia del DNA, della clorofilla, gli antigeni intracellulari, l'attività enzimatica, i burst ossidativi, il glutatione e l'aderenza delle cellule possono essere misurati similmente facendo uso di questo metodo.

Come i cytometers di flusso funzionano?

Fluidics

Durante la citometria a flusso, un liquido della guaina dal punto di vista idrodinamico mette a fuoco la sospensione delle cellule attraverso un piccolo ugello tali che soltanto una cella passa la luce laser per volta. Un rivelatore è collocato davanti al raggio laser tali che può catturare l'indicatore luminoso sparso di andata dalle celle, mentre parecchi rivelatori egualmente sono collocati ai lati per misurare la quantità e l'intensità di indicatore luminoso sparse in ogni direzione.

Lo spargimento di andata si riferisce all'indicatore luminoso rifranto da una cella che sta viaggiando nella stessa direzione come stava viaggiando originalmente. La proporzione di indicatore luminoso che in avanti è sparso è correlata con la dimensione delle cellule, dove le più grandi particelle producono l'indicatore luminoso sparso più di andata.

Lo spargimento laterale si riferisce all'indicatore luminoso rifranto che è ortogonale alla direzione del percorso leggero. L'indicatore luminoso sparso lato fornisce informazioni sulla granularità, dove le celle altamente granulari producono più indicatore luminoso laterale sparso rispetto alle celle a granularità bassa.

Per esempio, mentre eseguono la citometria a flusso dei campioni di sangue, i grandi e granulociti granulari mostrano un alto spargimento di andata e laterale; monociti che sono grande ma manifestazione non granulare un alto spargimento laterale di andata ma più basso. Quindi, in base alla proporzione di indicatore luminoso che è tipi sparsi e differenti di andata e laterali di popolazioni può essere separato.

Separazione basata sull'emissione di fluorescenza

Oltre allo spargimento di andata e laterale, i tipi differenti di celle possono anche essere separati hanno basato sull'indicatore luminoso emesso dalle molecole fluorescenti. Questa fluorescenza può essere dovuto i materiali naturalmente stanti flourescenti dentro una cella, o gli anticorpi fluorescenza-etichettati. Per esempio, il fluorocromo è usato per macchiare una proteina di interesse in modo che la luce laser di incidente della lunghezza d'onda appropriata permetta le celle che contengono questa proteina da individuare.

Mentre una cella attraversa il raggio laser, un impulso dell'emissione del fotone è creato. Questo impulso è individuato dal tubo di fotomoltiplicatore ed è convertito in impulso di tensione, che può essere interpretato dal cytometer di flusso. Più alta l'intensità di fluorescenza, più alto l'impulso di tensione.

Interpretazione di dati

Ogni cella che attraversa la luce laser è individuata come evento separato. Inoltre, tipi differenti di indicatori luminosi individuati: adi andata-spargimento, lo laterale spargimento e le lunghezze d'onda specifiche dell'emissione della fluorescenza, è definito un canale distinto. I dati per ciascuno di questi eventi sono tracciati indipendente e possono essere rappresentati con due metodi: istogrammi e punto-tracciati.

Gli istogrammi confrontano un singolo parametro, dove l'intensità è tracciata su un asse ed il numero degli eventi è tracciato su un asse separato. i Punto-tracciati possono confrontare simultaneamente più di un parametro, dove ogni evento video mentre i valori dell'intensità ed unici di due o tre canali sono rappresentati sul vario asse.

In questo scenario, gli eventi che hanno simile le intensità ragruppano insieme nel tracciato del punto. Mentre i punto-tracciati possono confrontare insieme i parametri multipli, gli istogrammi sono più facili da leggere e capire. In molti casi, i punto-tracciati e gli istogrammi non sono reciprocamente - l'esclusiva ed in molti esperimenti di citometria a flusso entrambi i tipi di grafici è tracciata per rappresentare e valutare i dati multi-parametrici.

Gating in citometria a flusso

Gating è un metodo impiegato in citometria a flusso dove più informazioni sono raccolte preferenziale circa una sottopopolazione sicura delle celle. Ciò aggiunge ulteriore risoluzione a citometria a flusso e può essere usata per analizzare i parametri multipli.

In un esperimento gated di citometria a flusso, i dati sono raccolti circa uno o più canali dal punto-tracciato. Poi, un contenitore di portone è tirato e una sottopopolazione delle celle è selezionata per la più analisi. Questa sottopopolazione è evidenziata in altri tracciati che video le informazioni dai canali alternati. Questo metodo contribuisce a fornire la maggior flessibilità e la risoluzione unicellulare per ogni canale.

Sorgenti

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Last Updated: Jun 28, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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