Metodologia do Cytometry de fluxo, usos, e análise de dados

O cytometry de fluxo é usado para determinar as propriedades físicas e químicas das pilhas em uma população heterogênea. Usando este método, os parâmetros múltiplos de únicas pilhas podem ser analisados simultaneamente. Este artigo descreve os princípios básicos de cytometry de fluxo, é aplicações e como os dados cytometric podem ser analisados.

Este artigo cobrirá:

Imagem das pilhas e dos anticorpos que poderiam ser analisados usando o cytometry de fluxo.Design_Cells | Shutterstock

Princípios básicos de cytometry de fluxo

O cytometry de fluxo é usado quando há uma necessidade de perfilar um grande número pilha diferente dactilografa dentro uma população. As pilhas são separadas com base em diferenças em tamanho e em morfologia. Adicionalmente, os anticorpos fluorescente-etiquetados que visam antígenos específicos na superfície da pilha podem ser usados para identificar e segregar várias subpopulações.

As etapas básicas incluem a passagem das pilhas através de um canal estreito, tal que cada pilha está iluminada por um laser um de cada vez. Uma série de sensores detecta então a luz refratada ou emissora, e estes dados são integrados e compilados para gerar a informação sobre a amostra.

Que pode o cytometry de fluxo ser usado para medir?

O cytometry de fluxo ajuda a analisar simultaneamente diversos parâmetros de uma pilha. Alguns destes parâmetros são descritos abaixo:

Análise funcional

Este método pode determinar a actividade biológica dentro das pilhas, tais como a geração de espécie reactiva do oxigênio, de mudanças mitocondriais da membrana durante o apoptosis, de taxas da fagocitose nas bactérias etiquetadas, de índice nativo do cálcio, e de índice em mudança do metal na resposta da resposta às drogas, etc.

Determinando a viabilidade da pilha

Este método pode igualmente ser usado para avaliar a viabilidade da pilha após a adição de organismos patogénicos ou de drogas. Toda a ruptura na integridade da membrana de pilha pode ser as tinturas de utilização determinadas que podem entrar na membrana de pilha puncionada. As pontas de prova fluorescentes tais como o bis-oxonol podem ligar às proteínas actuais na membrana de pilha, reservando para a identificação de várias fases da necrose.

Apoptosis e necrose de medição

O Apoptosis ou a morte celular programada são acompanhados das mudanças características na forma da pilha, na perda de estruturas, no destacamento da pilha, na condensação do citoplasma, no encolhimento da pilha, na fagocitose de resíduos celulares e nas mudanças no envelope nuclear.

Algumas das mudanças bioquímicas incluem o proteolysis, a desnaturação do ADN, a desidratação da pilha, a proteína queligam, e uma elevação nos íons livres do cálcio. Estas mudanças físicas e bioquímicas podem ser detectadas usar o cytometry de fluxo.

Oncosis é um evento necrotic onde a pilha comece inchar um pouco do que encolhe. Isto conduz à ruptura da membrana de plasma e da liberação das enzimas proteolytic que podem igualmente danificar os tecidos circunvizinhos. Estas mudanças na forma da membrana e da pilha de plasma podem ser avaliadas usando o cytometry de fluxo.

Análise do ciclo de pilha

A quantidade de ADN actual no núcleo varia durante cada fase do ciclo de pilha. Esta variação no índice do ADN pode ser avaliada usando as tinturas fluorescentes que ligam ao ADN ou aos anticorpos monoclonais, que podem permitir a detecção de expressão do antígeno.

Outros factores que incluem o índice de pigmentos da pilha tais como a variação do número da clorofila, de cópia do ADN, antígenos intracelulares, a actividade enzimático, explosões oxidativos, glutatione, e aderência da pilha podem similarmente ser medidos usando este método.

Como os cytometers do fluxo trabalham?

Fluídica

Durante o cytometry de fluxo, um líquido da bainha focaliza hidrodinâmico a suspensão da pilha através de um bocal pequeno tais que somente passagens de uma célula o laser em um momento. Um detector é colocado na frente do raio laser tais que pode capturar a luz dispersada dianteira das pilhas, quando diversos detectores forem colocados igualmente aos lados para medir a quantidade e a intensidade da luz dispersadas em cada sentido.

O scatter dianteiro refere a luz refratada por uma pilha que esteja viajando no mesmo sentido que viajava originalmente. A proporção de luz que é dispersada para a frente é correlacionada com o tamanho de pilha, onde as partículas grande-feitas sob medida produzem uma luz dispersada mais dianteira.

O scatter lateral refere a luz refratada que é ortogonal ao sentido do trajecto leve. A luz dispersada lado fornece a informação sobre a granulosidade, onde as pilhas altamente granuladas produzem mais luz lado-dispersada comparada às pilhas com a baixa granulosidade.

Por exemplo, ao executar o cytometry de fluxo de amostras de sangue, os grandes e granulocytes granulados mostram um scatter dianteiro e lateral alto; monocytes que são grande mas mostra nao granulada um scatter lateral dianteiro mas mais baixo alto. Assim, com base na proporção de luz que é tipos dispersados, diferentes dianteiros e laterais de populações pode ser separado.

Separação baseada na emissão da fluorescência

Independentemente do scatter dianteiro e lateral, os tipos diferentes de pilhas podem igualmente ser separados basearam na luz emissora por moléculas fluorescentes. Esta fluorescência pode ser devido aos materiais naturalmente de brilho dentro de uma pilha, ou aos anticorpos fluorescência-etiquetados. Por exemplo, o fluorochrome é usado para manchar uma proteína do interesse de modo que o laser do incidente do comprimento de onda apropriado permita as pilhas que contêm esta proteína a ser detectada.

Enquanto uma pilha passa através do raio laser, um pulso da emissão do fotão está criado. Este pulso é detectado pela câmara de ar de photomultiplier e convertido a um pulso de tensão, que possa ser interpretado pelo cytometer do fluxo. Mais alta a intensidade da fluorescência, mais alto o pulso de tensão.

Interpretação dos dados

Cada pilha que passa através do laser é detectada como um evento separado. Também, tipos diferentes de luz detectada: dianteiro-scatter, o lado-scatter, e os comprimentos de onda específicos da emissão da fluorescência, são atribuídos um canal distinto. Os dados para cada um destes eventos são traçados independente e podem ser representados por dois métodos: histogramas e ponto-lotes.

Os histogramas comparam um único parâmetro, onde a intensidade seja traçada em uma linha central e o número de eventos seja traçado em uma linha central separada. os Ponto-lotes podem comparar mais de um parâmetro simultaneamente, onde cada evento é indicado enquanto um único ponto e os valores da intensidade de dois ou três canais são representados na vária linha central.

Nesta encenação, os eventos que têm similar intensidades aglomeram-se junto no lote do ponto. Quando os ponto-lotes puderem comparar parâmetros múltiplos junto, os histogramas são mais fáceis de ler e compreender. Em muitos casos, os ponto-lotes e os histogramas não são mutuamente exclusivos, e em muito cytometry de fluxo experimentam ambos os tipos de gráficos são traçados representar e avaliar dados multi-paramétricos.

Bloquear no cytometry de fluxo

Bloquear é um método usado no cytometry de fluxo onde mais informação é recolhida preferencial sobre uma determinada subpopulação das pilhas. Isto adiciona uma definição mais adicional ao cytometry de fluxo e pode ser usado para analisar parâmetros múltiplos.

Em uma experiência bloqueada do cytometry de fluxo, os dados são recolhidos sobre uns ou vários canais do ponto-lote. Então, uma caixa da porta é desenhada e uma subpopulação das pilhas é seleccionada para mais análise. Esta subpopulação é destacada em outros lotes que indicam a informação dos canais alternativos. Este método ajuda a fornecer a maior definição da flexibilidade e da único-pilha para cada canal.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Jun 28, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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